半岛bd体育手机客户端 及特点

牛病毒性腹泻-粘膜病(Bovine viral diarrhea-mucosal disease，BVD-MD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus，BVDV)引起的以粘膜发炎、糜烂、坏死和腹泻等特征为主的疾病。该病在世界各地广泛流行和传播，一些畜牧业发达的国家尤其严重。因此，BVDV的快速准确鉴定，对该病的预防和检疫有着重要作用。本半岛bd体育手机客户端 是根据 PCR原理开发的牛病毒性腹泻病毒检测的试剂盒。它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供样品 RNA模板。

2、提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

3、半岛bd体育手机客户端 精心优化且特异性高，引物是根据牛病毒性腹泻病毒 RNA高度保守区设计，不会跟除此之外的其它病毒 RNA发生交叉反应。

4、RT-PCR mix中含上样染料，扩增反应后可以直接上样电泳。

5、本半岛bd体育手机客户端 足够 50次 20μL体系的 PCR反应。

6、本半岛bd体育手机客户端 只能用于定性实验，不能用于定量。

7、本半岛bd体育手机客户端 只能用于科研。

规格及成分

成份	编号	五孔盒包装
2×RT-PCR Buffer	91202A	500 μL(棕色管)
20×RT Enzyme Mix	91202B	50 μL(红盖)
超纯水	100935	1 mL(白盖)
牛病毒性腹泻病毒 RT-PCR引物混合液	13-59800yw	100 μL(绿盖)
牛病毒性腹泻病毒 RT-PCR阳性对照(1×106拷贝/μL)	59800pc	50 μL(黄盖)
使用手册	13-59800sc	1份

注：为避免扩散传染性病原，本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照，只提供专一的核酸片段作为阳性对照。

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为 12个月。

自备试剂

样品 DNA

使用方法

一、样品 DNA的制备

1、如果有 N个样品，必须设置 N+2个提取反应，多出的两个中一个是 PC(样品制备阳性对照)，一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL牛病毒性腹泻病毒 PCR阳性对照(1×10⁶拷贝/μL，本试剂盒提供)再加上一定量的水作为制备的阳性对照(加水后其总体积跟样品一样，样品体积多

少取决于所用试剂盒的要求)。可以用水作为制备的阴性对照。

2、用自选方法纯化上述 N+2个样品的 DNA。本试剂盒跟市场上大多数细菌 DNA提取试剂盒兼容。

二、设置 PCR反应(20μL体系)

3、标记 N+4个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 DNA样品，额外增加的两个管一个用于 PCR阳性对照，另一个用于 PCR阴性对照。按照下表在各 PCR管中加入下列成分：

成分/每管	样品管N+2个	PCR阴性对照	PCR阳性对照
2×RT-PCR Buffer	10 μL	10 μL	10 μL
牛病毒性腹泻病毒 PCR引物混合液	2 μL	2 μL	2 μL
制备的 N+2个 DNA样品	7 μL	-	-
超纯水	-	7 μL	-
牛病毒性腹泻病毒 PCR阳性对照的 10倍稀释液	-	-	7 μL
20×RT Enzyme Mix	1 μL	1 μL	1 μL

4、上机进行 PCR，PCR反应参数为:

过程	温度	时间
逆转录	50℃	20 min
预变性	95℃	10 min
PCR反应(40个循环)	95℃	15 sec
PCR反应(40个循环)	60℃	60 sec
延伸	72℃	10 min

三、电泳分析

5、取 5-10uL扩增产物进行常规琼脂糖电泳，检测扩增效果，由于扩增产物较短，建议用 1.5%-2.0%的琼脂糖凝胶。

6、阳性样品预期得到的扩增产物长度为 220bp左右。如果两个阴性对照(样品制备阴性对照或 PCR阴性对照)有此扩增产物，说明环境污染，则整个实验无效，不需要分析实验结果。

7、如果所有样品和 PCR阳性对照均无此扩增产物，则说明有系统性的问题(试剂、设备、程序、操作等)，需要重复并排查原因。

8、如果没有上述两种情况，则实验有效，可以分析样品的扩增结果。N+2个样品中有扩增产物的判定为阳性，无则判定为阴性。