半岛bd体育手机客户端 及特点

利什曼原虫(Leishmania spp)泛指利什曼虫属的锥体虫科原虫，是一种会引起利什曼病的寄生虫。利什曼原虫的主要宿主为脊椎动物，常见的感染对象包括蹄兔目、啮齿目、犬科、和人类。目前全世界有 88个国家报告过利什曼原虫症的病例，感染人数达 1,200万人。对人和哺乳动物致病的利什曼原虫有：引起人体内脏利什曼病的为杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)，引起皮肤利什曼病的为热带利什曼原虫(L．tropica)和墨西哥利什曼原虫(L．mexicana)，引起粘膜皮肤利什曼病的为巴西利什曼原虫(L．araziliensis)等。我国的黑热病是由杜氏利什曼原虫引起的。因此快速检测利什曼原虫具有重要意义。本半岛bd体育手机客户端 就是以探针法荧光定量 PCR技术为基础开发的专门检测利什曼原虫通用的试剂盒，它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供样品 DNA模板。

2、引物和探针经过优化，灵敏性高。

3、提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4、特异性高，引物是根据利什曼属原虫高度保守区设计，不会跟其他微生物的

DNA发生交叉反应，但可以检测到上述的几种利什曼属原虫。

5、本半岛bd体育手机客户端 足够 50次 20μL体系的探针法荧光定量 PCR反应。

6、本半岛bd体育手机客户端 只能用于科研。

规格及成分

成分	编号	十孔盒包装
2×Probe qPCR MagicMix	190303	0.5 mL(本色盖)
荧光 PCR专用模板稀释液	180701	1 mL(黄盖)
利什曼原虫通用探针法 qPCR引物混合液	15-18600yw	100 μL(白盖)
利什曼原虫通用 qPCR探针	15-18600pb	50 μL(棕色管)
利什曼原虫通用探针法 qPCR阳性对照(1×108拷贝/μL)	60908-18600pc	50 μL(黄盖)
核酸释放剂试用装	61202	20次(1mL，绿盖)
使用手册	15-18600sc	1份

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为 12个月。

自备试剂

样品 DNA。

使用方法

一、稀释标准曲线样品(以 10²-10⁷拷贝/μL这 6个 10倍稀释度为例)。

由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免扩散传染性病原，本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA片段作为阳性对照。

1、标记 6个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。

2、用带芯枪头分别加入 45 μL荧光 PCR专用模板稀释液，**用带芯枪头，下同)。

3、在 7号管中加入 5 μL 1×10⁸拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁷拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4、换枪头，在 6号管中加入 5 μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5、换枪头，在 5号管中加入 5 μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1分钟，得 1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6、重复上面的操作直到得到 6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。二、样品 DNA的制备

7、如果有 N个样品，**设置 N+2个提取，多出的一个是 PC(样品制备阳性对照)，一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL阳性对照的 10000倍稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为 PC。另外用水作为 NC。

8、用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数真菌 DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的真菌 DNAout或柱式真菌 DNAout。本试剂盒免费赠送 20次免 DNA提取的核酸释放剂，本半岛bd体育手机客户端 的裂解液可以直接作为 PCR模板，省略了 DNA提取步骤。

三、Probe qPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

9、如果进行定量分析，则标记 N+9个 PCR管，其中 N+2个用于上步得到的 N+2个样品，1个用于 PCR阴性对照，6个用于标准曲线样品。如果做定性分析，则 6个标准曲线样品只选一个做(可以选 4号，其余样品不变)。以下只介绍定量分析的反应设置。

10、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：

成分	样品管N+2个	PCR阴性对照管	标准曲线样品管(2-7管)
2×Probe qPCR MagicMix	10 μL	10 μL	各 10 μL
利什曼原虫通用 qPCR探针	1 μL	1 μL	各 1 μL
利什曼原虫通用探针法 qPCR引物混合液	2 μL	2 μL	各 2 μL
N+2个待测样品 DNA模板	6 μL	不加	不加
自备超纯水	不加	6 μL	不加
第 7步所得标准曲线样品稀释液(2-7号)	不加	不加	各 6μL(2号样到2号管，3号样到3号管…)

11、盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR：

过程	温度	时间
预变性	95℃	5 min
PCR反应(40个循环)	95℃	15秒
PCR反应(40个循环)	60℃	1 min(采集 FAM通道的荧光信号)

五、数据处理

12、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log值为横轴，以 Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct值从标准曲线上推算出样品 DNA浓度的 log值，再推算出其浓度。

13、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照 Ct必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于 30。对待测样品，如果其 Ct大于或等于 40则为阴性，如果小于或等于 35则为阳性。如果在 35-40之间，则重复一次。重复实验的 Ct值如果大于或等于 40则为阴性，如果小于 40，则为阳性。