半岛bd体育手机客户端 及特点

胞内劳森菌(Lawsoniaintracellularis)是一种严格的胞内寄生菌，主要存在于感染动物的肠黏膜上皮细胞内，可引起猪增生性肠炎。猪增生性肠炎是一种以回肠和结肠上皮细胞增生而导致肠黏膜增厚为主要特征的猪肠道传染病，临床上可引起发病猪食欲下降、腹泻和生长发育缓慢，多以亚临床感染为主。目前，猪增生性肠炎在世界养猪国家广泛存在，造成了严重的经济损失，被认为是危害世界养猪业的重要疫病之一。本半岛bd体育手机客户端 就是以探针法荧光定量PCR技术为基础开发的专门检测人疱疹病毒6型的试剂盒，它具有下列特点：

1、即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。

2、引物和探针经过优化，灵敏性高。

3、提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4、特异性高，引物是根据劳森菌DNA高度保守区设计，不会跟其他微生物的DNA发生交叉反应。

5、既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。

6、本半岛bd体育手机客户端 足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。

7、本半岛bd体育手机客户端 只能用于科研。

规格及成分

成分	编号
A	190303
B	180701
C	100935
D	15-67600yp
E	67600pc
使用手册	15-67600sc

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂

样品DNA。

使用方法

一、稀释标准曲线样品(以10E1-10⁶拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。为增加半岛bd体育手机客户端 稳定性和避免扩散传染性病原，本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。

1、标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。

2、用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液，**用带芯枪头，下同。

3、在6号管中加入5 μL 1×10⁷拷贝/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10⁶拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

4、换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10⁶拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁵拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

5、换枪头，在4号管中加入5 μL 1×10⁵拷贝/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10⁴拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。

6、重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品DNA的制备

7、如果有N个样品待提取，**设置N+2个提取，多出的是PC(样品制备阳性对照)和NC(样品制备阴性对照)。可以取阳性对照的1000倍稀释液10μL再加上一定量的水，使总体积与待提取样品的规定体积一致，以此作为PC。另外用水作为NC。

8、用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数DNA提取试剂盒兼容。

三、ProbeqPCR反应(20μL体系，在样品制备室进行)

9、如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，6个用于标准曲线。如果做定性分析，并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照(用水做模板)，1个用于PCR阳性对照(用第4号管的阳性对照稀释液做模板)。下面只以定量分析为例描述操作步骤。

10、在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加)：

成分/每管	样品管 N+2个	PCR阴性对照管	标准曲线 样品管(1-6管)
A	10μL	10μL	10μL
D	3 μL	3 μL	3 μL
N+2个待测DNA模板	7 μL	-	-
超纯水	-	7 μL	-
第6步所得标准曲线样品稀释液(1-6号)	-	-	7 μL(1号样到1号管，2号样到2号管…)

11、盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：

过程	温度	时间
预变性	95℃	10 min
PCR反应(45个循环)	95℃	15sec
	60℃	60sec(采集FAM通道的荧光信号)

四、数据处理

12、如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品核酸浓度的log值，再推算出其浓度。

13、如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于39。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于39则为阳性。如果在39-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。