半岛bd体育手机客户端 及特点

本试剂盒根据 RT-PCR原理开发的检测大麦黄矮病毒，它具有下列特点：

1、一站式，用户不需要单独准备每种成分，包括引物和对照。

2、根据大麦黄矮病毒的保守基因序列设计的引物，具有良好的特异性。

3、灵敏度可以达到 1000拷贝/反应。

4、本半岛bd体育手机客户端 足够 50次 20μL体系的 RT-PCR。

5、本半岛bd体育手机客户端 只能用于科研，不能用于临床。

规格及成分

成份	编号	十孔盒包装
5×双酶一管式 RT-PCR Buffer	91202a	200 μL(橘黄盖)
MMLV-Taq Mix	91202b	75 μL(红盖)
超纯水	100935	1 mL(亮黄盖)
大麦黄矮病毒 RT-PCR引物混合液	13-1330yw	100 μL(白盖)
大麦黄矮病毒 RT-PCR阳性对照(1×108拷贝/μL)	60908-1330pc	50 μL(黄盖)
使用手册	13-1330sc	1份

注：为避免扩散传染性病原，本半岛bd体育手机客户端 不提供活体样品做阳性对照，只提供专一的DNA片段作为阳性对照。

运输及保存

低温运输，-20℃保存，保存期限为 12个月。收到货后阳性对照需要跟其他成分分开放置，因为其容易污染其他成分，造成假阳性。

自备试剂

样品 RNA

使用方法

一、样品 RNA的制备1、如果有 N个样品，必须设置 N+2个提取，多出的一个是 PC(样品制备阳性对照)，一个是 NC(样品制备阴性对照)。可以用 10μL大麦黄矮病毒 RT-PCR阳性对照的 1000倍稀释液作为制备的阳性对照。可以用水作为制备的阴性对照。制备所得成为样品 RNA。

2、用自选方法纯化 N+2个样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA提取试剂盒兼容。可以选购本公司的柱式病毒 RNAout。

二、设置 RT-PCR反应(20μL体系)

3、如果有 N+2个样品，则标记 N+4个 PCR管(额外增加的两个管一个是 RT-PCR阳性对照，另一个是 RT-PCR阴性对照)并按照下表在 PCR管中加入下列成分：

成份	N+2个样品管	RT-PCR阴性对照	RT-PCR阳性对照
5×双酶一管式 RT-PCR Buffer	各 4 μL	4 μL	4 μL
大麦黄矮病毒 RT-PCR引物混合液	各 2 μL	2 μL	2 μL
N+2个制备的 RNA样品	各 12.5 μL	-	-
超纯水	-	12.5 μL	-
大麦黄矮病毒 RT-PCR阳性对照的1000倍稀释液	-	-	12.5 μL
MMLV-Taq Mix	1.5 μL	1.5 μL	1.5 μL

4、上机进行 RT-PCR，RT-PCR反应参数为:

过程	温度	时间
逆转录	42℃	30 min
预变性	95℃	5 min
PCR反应(35个循环)	95℃	30 sec
PCR反应(35个循环)	55℃	30 sec
PCR反应(35个循环)	72℃	20 sec
延伸	72℃	7 min

5、琼脂糖电泳检测扩增效果。如果阴性对照有扩增产物或阳性对照无扩增产物，则说明实验失败，需要分析实验失败的原因。只有在阴性对照没有扩增产物、阳性对照必须有预期大小条带出现，才有必要分析样品的实验结果，如果有预期片段大小的扩增产物则为阳性，如果无则为阴性。