Rab5 Pull-Down Activation Assay Kit

Cat. # 83701

Introduction

蛋白A/G琼脂糖拉下。最后用Anti-Rab5 Rabbit Polyclonal Antibody免疫印迹法检测沉淀的Rab5-GTP。

C.试剂盒组件

1.抗rab5 - gtp小鼠单克隆抗体(Cat。# 26911): 1瓶- 35 μL (1 mg/ml) PBS, pH 7.4，含50%甘油。该抗体特异性识别来自所有脊椎动物的Rab5-GTP。

2.蛋白质A/G琼脂糖(猫。# 30301):一个小瓶- 600 μL 50%的浆液。

3.5X分析/裂解缓冲液(Cat。# 30302):一瓶- 30 mL 250 mM Tris-HCl, pH 8, 750 mM NaCl, 50 mM MgCl2, 5 mM EDTA, 5% Triton X-100。

4.抗rab5兔多克隆抗体(Cat。# 21151): 1瓶- 50 μL (1 mg/mL) PBS, pH值7.4，含有50%甘油。

5.100X GTPγS (Cat。# 30303): 1瓶- 50 μl 10 mM，使用5 μl GTPγS对0.5 mL细胞裂解液进行gtp标记。

6.100倍GDP (Cat。# 30304):一个小瓶- 50 μl在100 mM，使用5 μl GDP用于GDP标记0.5 mL细胞裂解液。

7.hrp -山羊抗兔IgG(猫。#29002): 50 μL (0.4 mg/mL) PBS, pH值7.4，含50%甘油。

D.需要但未提供的材料

1.刺激和非刺激细胞裂解物

2.蛋白酶抑制剂

3.4°C管摇杆或激振器

4.0.5 M EDTA, pH 8.0

5.1.0 M MgCl2

6.减少2倍的SDS-PAGE样品缓冲液

7.电泳和免疫印迹系统

8.免疫印迹洗涤缓冲液，如TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween-20)

9.免疫印迹阻断缓冲液(含5%脱脂干乳或3%牛血清白蛋白的TBST)

10.ECL检测试剂

E.示例结果

下图演示使用Rab5活化测定试剂盒所看到的示例结果。仅供参考。

Rab5激活实验。用GDP(左道)或GTPγS(右道)处理纯化的全长Rab5蛋白后进行免疫共沉淀。用抗rab5 - gtp单克隆抗体(Cat。# 26911)。免疫印迹法检测抗rab5多克隆抗体(Cat。#。21151)。

试验过程

A.试剂制备

1X测定/裂解缓冲液:混合5X原液(Cat。# 30301)并在去离子水中稀释至1X。在使用前添加蛋白酶抑制剂，如1 mM PMSF、10 μg/mL白细胞肽素或10 μg/mL抑肽酶。

B.样品制备

贴壁细胞

1.培养细胞(一个10厘米的平板，约107个细胞)，约80-90%融合。根据需要用激活剂或抑制剂刺激细胞。

2.抽吸培养基，用冰冷的PBS冲洗两次。

3.完全去除最终PBS洗涤液，并将冰冷的1X测定/溶解缓冲液(参见试剂制备)添加到细胞中(每10 cm组织培养板0.5-1 mL)。

4.将培养板放在冰上10-20分钟。

5.用刮板将电池从板上刮下来。

6.将裂解物转移到合适大小的试管中并置于冰上。

7.如果发生核溶解，细胞溶解物可能变得粘稠，难以移液。如果发生这种情况，则可将裂解物通过27?号注射器针头3-4次，以剪切基因组DNA。

8.通过在12,000 x g和4℃离心10分钟来清除裂解产物。

9.收集上清液并将样品(~1-2 mg总蛋白)储存在冰上以备即时使用，或快速冷冻并储存在-70℃以备日后使用。

贴壁细胞

1.培养细胞并根据需要用激活剂或抑制剂进行刺激。

2.进行细胞计数，然后通过离心将细胞制成颗粒。

3.抽吸培养基，用冰冷的PBS冲洗两次。

4.完全去除最终PBS洗涤并将冰冷的1X测定/溶解缓冲液(参见试剂制备)添加到细胞颗粒(0.5-1 mL / 107个细胞)。

5.通过反复移液溶解细胞。

6.将裂解物转移到合适大小的试管中，并将其置于冰上。

7.如果发生核溶解，细胞溶解物可能变得粘稠，难以移液。如果发生这种情况，则可将裂解物通过27?号注射器针头3-4次，以剪切基因组DNA。

8.通过在12,000 x g和4℃离心10分钟来清除裂解产物。

9.收集上清液并将样品储存在冰上以备即时使用，或快速冷冻并储存在-70°C以备日后使用。

C. GTPγS/GDP蛋白体外阳性和阴性对照

注:体内刺激细胞将激活约10%的Rab5，而体外负载GTPγS蛋白将激活近90%的Rab5。

1.将0.5 mL细胞提取液(或1 μg纯化的Rab5蛋白)分入两个微离心管中。

2.每管加入20 μL 0.5 M EDTA(终浓度20 mM)。

3.阳性对照:加入5 μL 100 X GTPγS (Cat;# 30302)到**管

4.阴性对照:加入5 μL 100 × GDP (Cat。# 30304)连接到**管。

5.在搅拌的情况下，在30℃孵育两管30分钟。

6.通过将管置于冰上并添加32.5 μL 1 M MgCl2(最终浓度为60 mM)来停止加载。

D.活化G蛋白的亲和力沉淀

1.将0.5-1 mL细胞裂解物(约1 mg总细胞蛋白)分拆至微离心管中。

2.用1X测定/溶解缓冲液将体积调整为1 mL(参见试剂制备)。

3.加入1 μL抗rab5 - gtp抗体(Cat。# 26911)。

4.制备蛋白A/G琼脂糖珠浆(Cat。# 30301)通过顶点或滴定重悬。

5.快速加入20 μL重悬珠浆至上述管中。

6.在4℃下将管缓慢搅拌1小时。

7.通过5,000 x g离心1 min使珠粒成球。

8.抽吸并丢弃上清液(确保不要干扰或移除珠粒)。

9.用0.5 mL 1X测定/裂解缓冲液洗涤3次，每次离心并抽吸。

10.在第三次洗涤后，通过离心使珠粒成球并小心地去除所有上清液。

11.在20 μL 2X还原SDS- PAGE样品缓冲液中重悬小球。

12.将样品煮沸5分钟。

E. Western Blot分析

1.将15 μL/孔下拉上清液装入聚丙烯酰胺凝胶(17%)中。建议包括预染色MW标准(作为以下步骤3中成功转移的指标)。

2.按照制造商的说明进行SDS-PAGE。

3.按照制造商的说明将凝胶蛋白转移到PVDF或硝酸纤维素膜上。

注:步骤4-11在室温下搅拌

4.电印迹后，将PVDF膜浸入100%甲醇中15秒，然后在室温下干燥5分钟。

注:如果使用硝酸纤维素代替PVDF，应跳过步骤4。

5.在室温下用5%脱脂干乳或3%牛血清白蛋白在TBST中封闭膜1小时，并持续搅拌。

6.用TBST清洗3次，每次5分钟。

7.用抗rab5兔多克隆抗体(Cat。# 21151)，用5%脱脂干牛奶或3% BSA在TBST中以1:50 ~500(取决于样品中Rab5蛋白的量)新鲜稀释，在室温下持续搅拌1-2小时或在4℃过夜。

8.用TBST清洗3次，每次5分钟。

9.用二抗(Cat。# 29002)，用5%脱脂干乳或3%牛血清白蛋白(BSA)在TBST中以1:1000的比例新鲜稀释，在室温下恒定搅拌1小时。

10.用TBST清洗3次，每次5分钟。

11.使用您选择的检测方法，如ECL