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5′-核苷酸检测试剂盒(过碘酸氧化法)
5′-核苷酸检测试剂盒(过碘酸氧化法)图片
包装: 50T


半岛bd体育手机客户端 介绍

核酸(nucleic acid)是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物,是生命的基本物质之一,广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内,根据化学组成不同核酸可分为脱氧核糖核酸 (简称 DNA)和核糖核酸(简称 RNA),核酸分子中含有一定比例的磷,DNA中磷含量为 9.2%, RNA中磷含量为 9.0%。

5′-核苷酸检测试剂盒(过碘酸氧化比色法)检测原理是 5′-核苷酸核糖基的 2′、3′碳原子都有羟基,这两个碳原子之间的键较弱,过碘酸可氧化使其断裂生成二醛化合物,后者与甲胺基生成化合物,该化合物在酸性条件下脱下磷酸基,测定该无机磷量,即得 5′-核苷酸,无机磷与钼酸铵形成黄色的磷钼酸铵,随后还原剂把高价钼离子还原成低价钼离子,进而形成蓝色的钼蓝,在一定浓度范围蓝色深浅与磷含量成正比,在660nm处检测吸光度,通过检查标准曲线获得磷含量,同时为了消除其他无机磷的干扰,测定未经过碘酸氧化的无机磷,予以扣除,即为准确的 5′-核苷酸磷。该试剂盒的特点是专一测定 5′-核苷酸。该试剂盒仅用于科研领域,不适用于临床诊断或其他用途。

半岛bd体育手机客户端 组成:
名称 包装 储存
试剂(A):磷标准(1mg/ml)
1ml
4℃
试剂(B:过碘酸试剂
3ml
4℃避光
试剂(C): NA Assay Buffer
15ml
RT
试剂(D): NA显色液
15ml
RT避光
试剂(E):定磷试剂
E1:定磷试剂 A
50ml RT
E2:定磷试剂 B
20ml
RT
E3:定磷试剂 C
3g
RT
使用说明书
1份

自备材料:

1、蒸馏水、粗制 AMP或其他核酸

2、水浴锅、离心管或试管、分光光度计、比色杯

操作步骤(仅供参考):

1、稀释标准品:取适量的磷标准(1mg/ml),按磷标准(1mg/ml):蒸馏水=1:99的比例稀释标准品至 10μg/ml,取干净离心管或试管,按下表进行标准品浓度的依次稀释,获得不同浓度的多个磷标准。

加入物(ml) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
磷标准(10μg/ml) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
蒸馏水 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
磷含量(μg/ml) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

2、制备待测样液:取用粗 AMP水解液或 RNA水解液,作为待测样液。

3、配制定磷试剂:称取 1g定磷试剂 C加入 10ml蒸馏水,充分溶解,即为定磷试剂 C溶液。按 E1:E2:E3(定磷试剂 C溶液)=3:1:1混匀,即为定磷试剂,即配即用。

【注】定磷试剂 C溶液 4℃避光可以保存 1~2月,呈深黄色至棕色即失效。定磷试剂混合液配置后当天使用,正常颜色为黄色或黄绿色,如呈棕黄色或深绿色则失效。

4、磷加样:按下表进行操作,依次加入下列溶液,不能颠倒,每加一种试剂,必须充分混匀。如果样品中有无机磷,应同时检测无机磷,并将无机磷扣除。

加入物(ml) 空白管 标准管 氧化管 未氧化管
蒸馏水 1 0.5 0.5
系列磷标准(1~10号) 1
待测样液 0.5
过碘酸试剂 0.05 0.05 0.05 0.05
NA Assay Buffer 0.2 0.2 0.2 0.2
混匀,45℃孵育 10min。
待测样液 0.5
NA显色液 0.25 0.25 0.25 0.25
混匀,45℃孵育 10min。
定磷试剂
1.5
1.5
1.5
1.5
混匀,45℃孵育 10min。

4、磷测定:空白管调零,比色杯光径 1cm,分光光度计测定 660nm处标准管、氧化管、未氧化管的吸光度(分别记为 A标准、A氧化、A未氧化)。

计算:

以系列磷含量(μg/ml)(1~10号)为横坐标,吸光度为纵坐标作图,得标准曲线。氧化管为样液中所有磷的含量,未氧化管为样液未氧化前无机磷的含量,二者差值即为样液中5′-核苷酸磷含量。按下列公式计算样液中 5′-核苷酸的含量:

5′-核苷酸含量(mg/ml)=(C*M/31)×(N/1000)

式中:C=5′-核苷酸磷的质量浓度(μg/ml)

M=所测核苷酸相对分子量,如样液是 RNA水解液,则四种核苷酸的平均相对分子量为 340。

31=磷的相对原子质量 N=样液稀释倍数

1000=由μg换算为 mg的倍数

注意事项:

1、待测样品如不能及时测定,应置于 2~8℃保存,3天内稳定。

2、如果样品浓度过高,应用蒸馏水稀释后重测,结果乘以稀释倍数。

3、定磷试剂 A有腐蚀性,应小心操作。

4、定磷试剂 C溶液 4℃避光可以保存 1~2月,呈深黄色至棕色即失效。

5、定磷试剂配制后当天使用,正常颜色为黄色或黄绿色,如呈棕黄色或深绿色则失效。

6、在加样时,加入试剂的顺序应严格按照表格操作,不能颠倒,且加完后应充分摇匀并准确计时。

7、为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期:6个月有效;常温运输,4℃保存。
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