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己糖激酶(HK)活性检测试剂盒(微量法)
己糖激酶(HK)活性检测试剂盒(微量法)图片
包装: 100管/96样


半岛bd体育手机客户端 介绍

HK(EC 2.7.1.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是葡萄糖分解过程中的**个关键酶,催化葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途径的交叉点。

HK催化葡萄糖合成6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化6-磷酸葡萄糖脱氢生成NADpH,NADpH在340nm有特征吸收峰。

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

半岛bd体育手机客户端 组成:

半岛bd体育手机客户端 名称 规格 保存条件
提取液 液体100ml×1瓶 2-8℃
试剂一 液体20ml×1瓶 2-8℃
试剂二 粉剂×1瓶 2-8℃
试剂三 粉剂×2支 -20℃

溶液的配制:

1.试剂二:临用前加入18ml试剂一充分溶解,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴5min;用不完的试剂4℃保存一周;

2.试剂三:临用前取1支加入0.5 ml试剂一,充分溶解待用;用不完的试剂4℃保存一周。

自备材料:

紫外分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、研钵/匀浆器、冰。

操作步骤 (仅供参考) :

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(ml)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1ml提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g):提取液体积(ml)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1ml提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

血清(浆)样本:直接检测。

二、测定步骤

1.分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2.在微量石英比色皿或96孔板中加入180μL试剂二、10μL试剂三和10μL样本,混匀,立即记录340nm处20秒时的吸光值A1,比色后迅速将比色皿或酶标板连同反应液一起放入37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴或恒温箱中,准确反应5分钟;迅速取出比色皿并擦干,340nm下比色,记录5分20秒时的吸光度A2,计算 ΔA=A2-A1。

三、HK活性计算

A、用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1.血清(浆)HK活性单位的定义:每毫升血清(浆)在每分钟生成1nmol的NADpH定义为一个酶活力单位。

HK(U/ml)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=643×ΔA

2.组织、细菌或细胞中HK活性

(1)按样本蛋白浓度计算单位的定义:每mg组织蛋白每分钟生成1nmol的NADpH定义为一个酶活力单位。

HK(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=643×ΔA÷Cpr

(2)按样本质量计算单位的定义:每g组织每分钟生成1nmol的NADpH定义为一个酶活力单位。

HK(U/g质量)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=643×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞数量计算单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟生成1nmol的NADpH定义为一个酶活力单位。 HK(U/104cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=1.286×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:NADpH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.01ml;V样总:加入提取液体积,1ml;T:反应时间,5min;Cpr:样本蛋白质浓度, mg/ml;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

B、用96孔板测定的计算公式如下

1.血清(浆)HK活性单位的定义:每毫升血清(浆)在每分钟生成1nmol的NADpH定义为一个酶活力单位。

HK(U/ml)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=1071.7×ΔA

2.组织、细菌或细胞中HK活性

(1)按样本蛋白浓度计算单位的定义:每mg组织蛋白每分钟生成1nmol的NADpH定义为一个酶活力单位。

HK(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=1071.7×ΔA÷Cpr

(2)按样本质量计算单位的定义:每g组织每分钟生成1nmol的NADpH定义为一个酶活力单位。

HK(U/g质量)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总)÷T=1071.7×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞数量计算单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟生成1nmol的NADpH定义为一个酶活力单位。 HK(U/104cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=2.143×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:NADpH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:96孔板光径,0.6cm; V样:加入样本体积,0.01ml;V样总:加入提取液体积,1ml;T:反应时间,5min;Cpr:样本蛋白质浓度, mg/ml;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

注意事项:

1.比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃,取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水,将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

2.**两个人同时做此实验,一个人比色,一个人计时,以保证实验结果的准确性。

3.不同匀浆组织中HK活力不一样,做正式试验之前请做1-2次预试验,若ΔA>0.5,则说明组织活力太高,必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液(计算公式中乘以相应稀释倍数),或缩短反应时间至2min,使ΔA<0.5,以提高检测灵敏度。

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