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苹果酸合酶(MS)测试盒(微量法)
苹果酸合酶(MS)测试盒(微量法)图片
货号: MS-1-D
包装: 100管/96样


半岛bd体育手机客户端 介绍

正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

苹果酸合酶(MS,EC 4.1.3.2)是属于转移酶中酰基转移酶的一类,主要存在于植物和微生物中。MS是乙醛酸循环的关键酶之一,在 MS催化下乙醛酸与乙酰辅酶 A反应生成苹果酸。

测定原理:

MS催化乙酰 CoA和乙醛酸产生苹果酸,同时生成辅酶 A,辅酶 A使无色的 DTNB转变成黄色的 TNB,在 412nm处有特征吸光值。

需自备的半岛游戏平台官网入口网址 和用品:

酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、96孔板、研钵、冰、和蒸馏水

试剂组成和配制:

试剂一:液体 120 mL×1瓶,4℃保存;

试剂二:液体 10 mL×1瓶,4℃保存;

试剂三:粉剂×1瓶,-20℃保存;临用前加入 10mL试剂一充分溶解后使用,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

试剂四:粉剂×1瓶,4℃保存;临用前加入 2.4mL试剂一充分溶解后使用,用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

样本的前处理:

1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1的比例(建议 500万细菌或细胞加入 1mL试剂一),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2、组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10的比例(建议称取约 0.1g组织,加入 1mL试剂一),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤:

1、酶标仪预热 30min以上,调节波长至 412nm。

2、样本测定

在 96孔板中依次加入 20μL样本、80μL试剂二,80μL试剂三和 20μL试剂四,混匀,立即记录 412 nm处反应 5min时的吸光值 A1和 10min时的吸光值 A2,计算 ΔA=A2-A1。

MS活性计算:

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MS(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=294×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g组织每分钟催化产生 1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MS(nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=294×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每 1万个细菌或细胞每分钟催化产生 1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。

MS(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.588×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:TNB摩尔消光系数,1.36×104L/ mol/cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.02 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。

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