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组分
| P1021 | | |
| Pfu DNA聚合酶 | 2.5 U/μl | 100 μl |
| 10×Pfu Buffer(Mg2+ Plus) | | 1.25 ml |
| 6×Loading Buffer | | 1 ml |
| P1022 | | |
| Pfu DNA聚合酶 | 2.5 U/μl | 100 μl |
| 10×Pfu Buffer(Mg2+ Plus) | | 1.25 ml |
| dNTPs(各2.5 mM) | | 1 ml |
| 6×Loading Buffer | | 1 ml |
| P1023 | | |
| Pfu DNA聚合酶 | 2.5 U/μl | 400 μl |
| 10×Pfu Buffer(Mg2+ Plus) | | 1.25 ml×2 |
| 6×Loading Buffer | | 1 ml |
| P1024 | | |
| Pfu DNA聚合酶 | 2.5 U/μl | 400 μl |
| 10×Pfu Buffer(Mg2+ Plus) | | 1.25 ml×2 |
| dNTPs(各2.5 mM) | | 1 ml |
| 6×Loading Buffer | | 1 ml |
注： 10×Pfu Buffer分为Mg2+ Plus与Mg2+ Free两种包装，可方便选择。如没特别说明提供10×Pfu Buffer(Mg2+ Plus)。Mg2+ Free的10×Pfu Buffer提供25 mM MgCl2。
保存条件
-20℃保存2年。多次冻融不影响生物学活性。
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说明
Pfu DNA聚合酶是极端嗜热性细菌Pyrococcus furiosus来源的高度热稳定DNA聚合酶，分子量为90 KD。其保真性是普通Taq DNA聚合酶的10倍左右。扩增片段的长度可达2 kb(简单模板)。延伸速度为0.2-0.4 kb/ min(70~75℃)。该酶具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性。扩增产物具有平末端。
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特点
保真性最高：保真性是Taq DNA聚合酶的10倍。
热稳定性好：95℃处理2小时后，酶活性为未经处理酶的95%。
PCR产物具有平滑末端，可直接用于平端克隆。
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用途
高保真性PCR扩增
制备基因克隆或蛋白表达用的PCR产物
平末端PCR克隆
位点特异性突变
活性定义
一个活性单位(U)指用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，在72℃、30 min内，摄入10 nmol全核苷酸所需的酶量。
质量控制
相关测试表明无外源内切酶或外切脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶污染；PCR方法检测无宿主残余DNA，能有效扩增人基因组中的单拷贝基因；室温放置一周，扩增活性无明显改变。
10×Pfu Buffer
100 mM KCl
200 mM Tris-Cl
20 mM MgSO4
100 mM (NH4)2SO4
酶贮存液
20 mM Tris-HCl
1 mM DTT
0.1 mM EDTA
100 mM KCl
0.5 % TW 20
0.5 % NP 40
50 % Glycerol
应用举例
注：以下反应举例为50 μl标准PCR体系，仅供参考。实际PCR条件应根据模板、引物结构、目的片段大小加以优化，确定最佳反应条件。
以λ DNA为模板，扩增1kb片段。
| λ DNA(2.5 ng/μl) | 1 μl |
| 引物1(10 μM) | 2 μl |
| 引物2 (10 μM) | 2 μl |
| 10×PCR Buffer | 5 μl |
| dNTPs(2.5 mM/L) | 4 μl |
| Pfu DNA聚合酶(2.5 U/μl) | 1 μl |
| 超纯水 | 补足至50 μl |
PCR反应条件
| 95℃ | 3 min |
| 95℃ | 30 sec |
| 55~68℃ | 30 sec 30 Cycles |
| 72℃ | 2 min |
| 72℃ | 7 min |
注意事项
1、Pfu DNA聚合酶的扩增产物只有平末端，可直接用于平末端连接。
2、dUTP、dITP和含有这些核苷酸的引物不能用于Pfu DNA聚合酶催化的PCR扩增。因为该酶与含有尿嘧啶和次黄嘌呤的DNA模板结合后会中止DNA聚合反应。
3、建议在冰上配置PCR 反应液后，再放入PCR仪中进行扩增。这有利于提高扩增的特异性，减少非特异性扩增，得到良好的PCR结果。
4、碱基出错率是指在每个碱基合成过程中所掺入的错误核苷酸数目。Pfu DNA聚合酶的碱基错误率为1×10-6。
5、模板DNA推荐用量(50 μl PCR反应体系)
| 人类基因组DNA | 0.1 – 1 μg |
| λDNA | 0.5 – 5 ng |
| 质粒DNA | 0.1 – 10 ng |
| 大肠杆菌DNA | 10 – 100 ng |
Q&A
问：Pfu DNA聚合酶的保真性为何高于Taq DNA聚合酶？
答：这是由于Pfu DNA聚合酶具有3'→5'外切酶活性，可在扩增的过程中，切掉错配的碱基，降低碱基错配率。Taq DNA聚合酶的碱基错误率为1×10-5，而Pfu
DNA聚合酶的碱基错误率仅为1×10-6。Pfu DNA聚合酶主要用于基因筛选、克隆表达、突变检测、定点突变等对保真性有很高要求的实验。其扩增产物只具有
平末端，可直接用于平末端连接。要提高TA克隆效率，建议对PCR产物纯化后，加A再进行TA克隆。
问：Pfu DNA聚合酶能扩增多大的片段？
答：对于简单模板，可以扩增2 kb以下的片段。扩增长片段时，能否扩增成功主要与模板与引物的设计有关。为获得良好的扩增结果，建议引物长度大于18 bp，
Tm在55-80℃之间，浓度在0.1-0.5μM之间，略高于Taq。如需要很高的保真性，且又扩增较长片段时，建议选择Fusion pfu DNA聚合酶。
问：Pfu DNA聚合酶的扩增效率为何低于Taq DNA聚合酶？
答：这可能决定于Pfu DNA聚合酶本身的结构与特性。且具有核酸外切酶的活性，容易降解PCR引物。建议在配制PCR反应时，最后加入Pfu DNA聚合酶或使用
PfuMix。
问：使用Pfu DNA聚合酶扩增时，有没有必要在冰上配制PCR反应液？
答：有必要。建议在冰上配制PCR 反应液后，再放入PCR仪中进行扩增。这有利于提高扩增的特异性，减少非特异性条带背景，获得良好的PCR结果。
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