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注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 磷脂酶 D(EC 3.1.4.4)即磷脂酰胆碱水解酶，是催化磷酸二酯键水解和碱基交换反应的一类酶的总称，广泛存在于高等动植物和细菌等多种生物体中，具有参与细胞脂质代谢、信号传导、生物膜形成的抗逆境胁等生理功能。 磷脂酶 D催化水解磷脂酰胆碱末端的磷脂酰二酯键生成磷脂酸和胆碱，胆碱在胆碱氧化酶催化作用下生成甜菜碱和过氧化氢，过氧化氢在过氧化氢酶的作用下将 4-氨基安替比林和重蒸酚氧化成粉红色物质，在 500nm处有特征吸收峰。 半岛bd体育手机客户端 内容：
溶液的配制： 1.试剂三：临用前加 1ml无水乙醇充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。 需自备的半岛游戏平台官网入口网址 和用品： 天平、研钵、超速冷冻离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅、无水乙醇。 操作步骤： 一、酶液提取 1.组织：按照质量(g)：提取液体积(ml)为 1：5～10的比例(建议称取约 0.1g，加入 1ml提取液)加入提取液，冰浴匀浆后于 4℃，10000g离心 5min，取全部上清于 4℃、100000g离心 30min，弃上清，取沉淀溶于1ml试剂一。 2.细胞：按照细胞数量(104个)：提取液体积(ml)为 500～1000：1的比例(建议 500万细胞加入 1ml提取液)，冰浴超声波破碎细胞(功率 300w，超声 3秒，间隔 7秒，总时间 3min)；然后于 4℃，10000g离心 5min，取全部上清于 4℃、100000g离心 30min，弃上清，取沉淀溶于 1ml试剂一。 3.血清：直接测定。 二、测定操作
三、酶活计算公式 a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下 1.按照蛋白浓度计算 酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。 PLD活性(nmol/min/mg prot)=(A测定管÷A标准管)×C标准÷Cpr÷T=16.7×(A测定管÷A标准管)÷Cpr 2.按照样本质量计算 酶活性定义：每克组织每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。 PLD活性(nmol/min/g鲜重)=(A测定管÷A标准管)×C标准÷W÷T=16.7×(A测定管÷A标准管)÷W 3.按照细胞数量计算 酶活性定义：每104个细胞每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。 PLD活性(nmol/min/104cell)= (A测定管÷A标准管)×C标准÷细胞数量÷T=16.7×(A测定管÷A标准管)÷细胞数量 4.按照液体体积计算 酶活性定义：每毫升血清每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。 PLD活性(nmol/min/ml)=(A测定管÷A标准管)×C标准÷T=16.7×(A测定管÷A标准管) C标准：标准品浓度，500nmol/ml；Cpr：样本蛋白浓度，mg/ml；W：样本质量，g/ml；T：反应时间，30min。 b.用96孔板测定的计算公式如下 1.按照蛋白浓度计算 酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。 PLD活性(nmol/min/mg prot)=(A测定管÷A标准管)×C标准÷Cpr÷T=16.7×(A测定管÷A标准管)÷Cpr 2.按照样本质量计算 酶活性定义：每克组织每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。 PLD活性(nmol/min/g鲜重)=(A测定管÷A标准管)×C标准÷W÷T=16.7×(A测定管÷A标准管)÷W 3.按照细胞数量计算 酶活性定义：每104个细胞每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。 PLD活性(nmol/min/104cell)=(A测定管÷A标准管)×C标准÷细胞数量÷T=16.7×(A测定管÷A标准管)÷细胞数量 4.按照液体体积计算 酶活性定义：每毫升血清每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。 PLD活性(nmol/min/ml)=(A测定管÷A标准管)×C标准÷T=16.7×(A测定管÷A标准管) C标准：标准品浓度，500nmol/ml；Cpr：样本蛋白浓度，mg/ml；W：样本质量，g/ml；T：反应时间，30min。 注意事项： 1.显色完成后，若有沉淀，于8000rpm，25℃离心5min后取上清测定。 2.吸光值不宜超过1，否则用试剂一将酶液进行稀释，并在计算公式中乘以稀释倍数。 |
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