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焦磷酸:果糖-6-磷酸-1-磷酸转移酶(PFP)检测试剂盒(UV板,微量法)
焦磷酸:果糖-6-磷酸-1-磷酸转移酶(PFP)检测试剂盒(UV板,微量法)图片
包装: 100管/96样
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半岛bd体育手机客户端 介绍

焦磷酸:果糖-6-磷酸-1-磷酸转移酶(PFP,EC2.7.1.90)是一种胞质酶,广泛存在于植物组织中,与磷酸果糖激酶一样催化果糖-6-磷酸的磷酸化,单PEP催化反应为可逆反应,并以焦磷酸代替ATP,在光合作用碳代谢中起重要作用。

PFP催化6-磷酸果糖转化为1,6-二磷酸果糖,它在醛缩酶和磷酸丙糖异构酶的作用下转变为磷酸二羟丙酮,再由α-磷酸甘油脱氢酶和NADH催化生成3-二磷酸甘油和NAD,340nm处的吸光度变化反映了PFP的活性的高低。

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

半岛bd体育手机客户端 内容:

试剂名称 规格 保存条件
提取液 液体110ml×1瓶 2-8℃
试剂一 液体15ml×1瓶 2-8℃
试剂二 粉剂×1瓶 -20℃
试剂三 粉剂×1瓶 -20℃
试剂四 粉剂×2支 2-8℃
试剂五 粉剂×1支 -20℃
试剂六 液体30μL×1支 2-8℃

溶液的配制:

1.试剂二:临用前加2.5ml蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存两周,禁止反复冻融。

2.试剂三:临用前加2.5ml蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存两周,禁止反复冻融。

3.试剂四:临用前取1支加入0.3ml蒸馏水溶解,4℃保存一周。(1支粉剂溶解后可做100T,为了延长使用时间,此半岛bd体育手机客户端 多给1支粉剂)

4.试剂五:临用前加入0.3ml蒸馏水溶解,-20℃分装保存两周,禁止反复冻融。

5.试剂六:临用前加入0.3ml蒸馏水溶解,4℃保存一周,也可按比例现用现配。

需自备的半岛游戏平台官网入口网址 和用品:

可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水、EP管。

操作步骤:

一、样品处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1.组织:按照质量(g):提取液体积(ml)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g,加入1ml提取液)加入提取液,冰浴匀浆后于4℃,20000g离心15min,取上清置冰上待测;

2.细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(ml)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1ml提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3s,间隔7s,总时间3min);然后4℃,20000g离心15min,取上清置冰上待测;

3.液体:直接检测。

二、测定操作

1.分光光度计/酶标仪预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。

2.操作表:

试剂名称(μL) 测定管 空白管
试剂一 134 134
试剂二 20 20
试剂三 20 20
试剂四 2 2
试剂五 2 2
试剂六 2 2
样本 20 -
蒸馏水 - 20
充分混匀后于微量石英比色皿/96孔UV板中测定37℃条件下,340nm处初始值A1和30min的吸光值A2,分别记为A1测定管、A1空白管、A2测定管,A2空白管。计算ΔA=(A1测定管-A2测定管)-(A1空白管-A2空白管)。注:也可将试剂一、二、三、四、五、六按操作表比例,配制成工作液,现配现用;空白管只需做1-2次。

三、焦磷酸:

果糖-6-磷酸-1-磷酸转移酶活性的计算

1.按微量石英比色皿计算:

(1)按照样本蛋白浓度计算酶活单位定义:每毫克组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PFP(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V反总×109÷(V样×Cpr)÷T=53.59×ΔA÷Cpr

(2)按照样本质量计算酶活单位定义:每克组织每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PFP(U/g质量)=ΔA÷(ε×d)×V反总×109÷(W×V样÷V提取)÷T=53.59×ΔA÷W

(3)按照细胞数量计算酶活单位定义:每104个细胞每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

PFP(U/104cell)= ΔA÷(ε×d)×V反总×109÷(V样×细胞数量÷V提取)÷T=53.59×ΔA÷细胞数量

(4)按照液体体积计算酶活单位定义:每毫升液体每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。 PFP(U/ml)=ΔA÷(ε×d)×V反总×109÷V样÷T=53.59×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.02ml;V提取:加入提取液体积,1ml;T:反应时间,30min;Cpr:样本蛋白质浓度, mg/ml;W:样本质量,g;109:换算系数,1mol=109nmol。

2.按96孔UV板计算:

将上述公式中的d=1cm修改为d-0.6cm(96孔UV板光径)进行计算即可。

注意事项:

每次检测样本数不宜太多以免耽误过多的酶促反应时间。

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