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碱性蛋白酶(AKP)活性检测试剂盒(可见分光光度法)
碱性蛋白酶(AKP)活性检测试剂盒(可见分光光度法)图片
包装: 50管/24样
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半岛bd体育手机客户端 介绍

AKP是指在碱性条件下催化蛋白质肽键水解的酶类,属于丝氨酸蛋白酶。此外,该酶还能够水解酯键、酰胺键,具有转酯及转肽的功能。该酶是主要工业用酶之一,广泛应用于制药、丝绸、食品、制革等行业。

在碱性条件下,AKP水解酪蛋白生成酪氨酸;在碱性条件下,酪氨酸还原磷钼酸生成钨蓝;钨蓝在680nm有特征吸收峰,测定 680nm吸光度增加速率,来计算AKP活性。

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

半岛bd体育手机客户端 内容:

提取液:液体35ml×1瓶,4℃保存。

试剂一:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加10ml蒸馏水溶解。

试剂二:粉剂×1瓶,4℃避光保存。临用前加入10ml提取液,沸水浴中磁力搅拌溶解。

试剂三:液体50ml×1瓶, 4℃保存。

试剂四:液体10ml×1瓶,4℃保存。

标准品:液体1ml×1支,20μmol/ml标准酪氨酸溶液,4℃保存。

需自备的半岛游戏平台官网入口网址 和用品:

研钵/匀浆器、台式离心机、可见分光光度计、1ml玻璃比色皿、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1.5 mlEP管、冰和蒸馏水。

操作步骤:

一、粗酶液提取:

称取约0.1g组织,加入1ml提取液,冰上充分研磨,10000rpm 4℃离心10min,取上清液,即粗酶液,置冰上待测。或直接称取0.1g酶制品,加入1ml提取液,置冰上待测。

二、测定:

1、分光光度计预热30min以上,调节波长到680 nm,蒸馏水调零。

2、试剂一、试剂二和试剂三置于40℃水浴保温30min以上。

3、标准溶液的配制:临用前将20μmol/ml标准液用蒸馏水稀释80倍至0.25μmol/ml标准溶液使用,现用现配。

4、样本测定(在1.5mlEP管中依次加入下列试剂)

试剂名称(μL) 对照管 测定管 空白管 标准管
粗酶液 100 100

试剂一 200


试剂二
200

混匀后40℃水浴保温10min

试剂一


200

试剂二 200


混匀后10000rpm 4℃离心10min,取上清
上清 200 200

蒸馏水

200
标准品


200
试剂三 1000 1000 1000 1000
试剂四 200 200 200 200
混匀后40℃水浴保温20min

取1ml于1ml玻璃比色皿中,于680nm测定光吸收,分别记为A对照管、A测定管、A空白管、A标准管。并计算ΔA测定=A测定管-A对照管、ΔA标准=A标准管-A空白管。

三、碱性蛋白酶活性计算:

(1)按蛋白浓度计算

酶活单位定义:40℃每毫克蛋白每分钟催化水解产生1μmol酪氨酸为一个酶活单位。

AKP活性(U/mg prot)=C标准品×ΔA测定÷ΔA标准×V1÷(Cpr×V2)÷T=0.125×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr

(2)按样本质量计算

酶活单位定义:40℃每克样本每分钟催化水解产生1μmol酪氨酸为一个酶活单位。

AKP活性(U/g质量)=C标准品×ΔA测定÷ΔA标准×V1÷(W×V2÷V3)÷T=0.125×ΔA测定÷ΔA标准÷W

C标准品:0.25μmol/ml标准酪氨酸溶液; Cpr:粗酶液蛋白质浓度(mg/ml);W:样品质量(g);V1:酶促反应总体积(ml),0.5ml;V2:加入反应体系中粗酶液体积(ml),0.1ml;V3:粗酶液总体积(ml),1ml;T:催化反应时间(min),10min。

注意事项:

若反应较弱,(A测定管-A对照管)差值较小,可适当延长反应时间(20-30min),即**步水浴时间,最后计算酶活时对公式进行修改。

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