半岛bd体育手机客户端 介绍
肌酸激酶(Creatine Kinase，CK) (EC 2.7.3.2)也成为肌酸磷酸激酶，主要存在于心脏、肌肉以及脑等组织中，能可逆地催化肌酸与ATP之间的转磷酰基反应，是一个与细胞能量运转、肌肉收缩、ATP再生有直接关系的重要激酶。 CK催化磷酸肌酸和ADP生成肌酸和ATP，己糖激酶催化ATP与葡萄糖形成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶催化6-磷酸葡萄糖与NADP+生成NADpH，导致340nm光吸收值增加，以此来表示CK酶活。 注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 半岛bd体育手机客户端 内容：
溶液的配制： 1.试剂一：临用前加5ml蒸馏水溶解；用不完的分装后-20℃保存，禁止反复冻融； 2.试剂二：临用前加入0.5ml蒸馏水溶解；用不完的分装后-20℃保存，禁止反复冻融； 3.试剂三：临用前加入0.5ml蒸馏水溶解；用不完的分装后-20℃保存，禁止反复冻融； 4.试剂四：临用前加入0.65ml蒸馏水溶解；用不完的分装后-20℃保存，禁止反复冻融； 5.工作液：临用前根据用量将试剂一、试剂二、试剂三、试剂四、试剂五以70:4:7:10:90的比例混合(体积比)。现用现配。使用前室温孵育20min(该步骤不可省略)。 需自备的半岛游戏平台官网入口网址 和用品： 天平、低温离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔UV板、恒温水浴锅、研钵/匀浆器、蒸馏水。 操作步骤： 一、样本处理(可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献) 1.组织样本：按照组织质量(g)：提取液体积(ml)为1：5～10的比例(建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液)进行冰浴匀浆，然后10000g，4℃离心15min，取上清，置冰上待测。 2.血清样本：直接测定。 3.细胞样本：按照细胞数量(104个)：提取液体积(ml)为500～1000：1的比例(建议500万细胞加入1ml提取液)加入提取液，冰浴超声波破碎细胞(功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min)；然后于4℃，10000g离心10min，取上清待测。二、测定步骤 1.分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，用蒸馏水调零。 2.操作表：在微量石英比色皿/96孔板中加入下列试剂
三、CK活性计算 1.按微量石英比色皿计算 (1)按组织蛋白浓度计算： 酶活定义：37℃，pH7.0时，每毫克蛋白质每分钟催化产生1nmol NADpH为一个酶活单位。 CK活性(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×V反总×109÷(V样×Cpr)÷T=268×ΔA÷Cpr (2)按组织样本质量计算： 酶活定义：37℃，pH7.0时，每克样本每分钟催化产生1nmol NADpH为一个酶活单位。 CK活性(U/g质量)=ΔA÷(ε×d)×V反总×109÷(V样÷V样总×W)÷T=268×ΔA÷W (3)按血清体积计算： 酶活定义：37℃，pH7.0时，每ml血清每分钟催化产生1nmol NADpH为一个酶活单位。 CK活性(U/ml)=ΔA÷(ε×d)×V反总×109÷V样÷T=268×ΔA (4)按细胞数量计算： 酶活定义：37℃，pH7.0时，每1万个细胞每分钟催化产生1nmol NADpH为一个酶活单位。 CK活性(U/104cell)=ΔA÷(ε×d)×V反总×109÷(V样÷V样总×细胞数量)÷T=268×ΔA÷细胞数量 ε：NADpH的摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，2×10-4L；V样：反应体系中样本体积，0.04ml；V样总：提取液体积，1ml；Cpr：样本蛋白浓度，mg/ml；W：样本质量，g；细胞数量：以104为单位计算，万个；T：反应时间，3min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。 2.按96孔UV板计算将上述公式中的d=1cm改为0.6cm(96孔板光径)进行计算即可。 注意事项： 1.血清的CK不稳定，采集样本后尽快测定，4℃避光保存可稳定24h。 2.样本蛋白质含量需要另外测定。 3.OD值大于0.6可用提取液适当稀释样本，并在计算公式中相应的改变稀释倍数。 4.ΔA空白管一般不超过0.01。 |
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