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黄嘌呤氧化酶(XOD)活性检测试剂盒(微量法)
黄嘌呤氧化酶(XOD)活性检测试剂盒(微量法)图片
包装: 100管/96样
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半岛bd体育手机客户端 介绍

注意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。

XOD(EC 1.17.3.2)催化黄嘌呤氧化生成尿酸和超氧阴离子,是活性氧主要来源之一;同时也是核苷酸代谢的关键酶之一。XOD主要分布于哺乳动物的心,肺,肝脏等组织中,当肝功能受损时,XOD大量释放到血清中,对肝损害的诊断具有特异性的意义。

XOD催化黄嘌呤产生尿酸,尿酸在290nm下有特征吸收峰。

半岛bd体育手机客户端 内容:

提取液:液体100ml×1瓶,4℃保存;

试剂一:液体30ml×1瓶,4℃保存;

试剂二:粉剂×2瓶,4℃保存。

需自备的半岛游戏平台官网入口网址 和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵、冰和蒸馏水。

操作步骤:

一、粗酶液提取:

1、细菌、细胞或组织样品的制备收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每500万细菌或细胞加入1ml提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率20%,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。称取约0.1g组织,加入1ml提取液进行冰浴匀浆;8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。或者直接用0.5mg/ml的酶液直接测定,为保证实验准确性建议用提取液梯度稀释后测定。

2、血清(浆)样品:直接检测。

二、测定步骤:

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至290nm,蒸馏水调零。

2、XOD检测工作液的配制:用时在每瓶试剂二中加入15ml试剂一,充分混匀,待用;用不完的试剂4℃可保存一周。

3、测定前按需取出一定量的XOD检测工作液在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴30min以上。

4、空白管:在EP管中加入10μL水和250μL工作液,立即混匀并取200μL转移至微量石英比色皿或96孔板中,记录290nm下初始吸光值A1和1min后的吸光值A2。计算ΔA空白=A2-A1。

5、测定管:在EP管中加入10μL样本和250μL工作液,立即混匀并取200μL转移至微量石英比色皿或96孔板中,记录290nm下初始吸光值A1和1min后的吸光值A2。计算ΔA测定=A2-A1。

三、XOD活性计算:

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血清(浆)XOD计算:

单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟催化产生1μmol尿酸定义为一个酶活力单位。

XOD(U/ml)=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×106]÷V样÷T=2.131×ΔA

2、组织、细菌或细胞中XOD计算:

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1μmol尿酸定义为一个酶活力单位。

XOD(U/mg prot)=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×106]÷(Cpr×V样)÷T =2.131×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟催化产生1μmol尿酸定义为一个酶活力单位。

XOD(U/g鲜重)=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×106]÷(V样÷V样总×W)÷T=2.131×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每万个细胞每分钟催化产生1μmol尿酸定义为一个酶活力单位。

XOD(U/104cell)[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×106]÷(V样÷V样总×500)÷T=4.262×10-3×ΔA

V反总:反应体系总体积,2.6×10-4L;ε:尿酸摩尔消光系数,1.22×104L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.01 ml;V样总:加入提取液体积,1ml;T:反应时间,1min;W:样品质量,g;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/ml;500:细胞或细菌总数,500万。

b.用96孔板测定的计算公式如下

1、血清(浆)XOD计算:

单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟催化产生1μmol尿酸定义为一个酶活力单位。

XOD(U/ml)=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×106]÷V样÷T=3.552×ΔA

2、组织、细菌或细胞中XOD计算:

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1μmol尿酸定义为一个酶活力单位。

XOD(U/mg prot)=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×106]÷(Cpr×V样)÷T =3.552×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每g组织每分钟催化产生1μmol尿酸定义为一个酶活力单位。

XOD(U/g鲜重)=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×106]÷(V样÷V样总×W)÷T =3.552×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每万个细胞每分钟催化产生1μmol尿酸定义为一个酶活力单位。

XOD(U/104cell)[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×106]÷(V样÷V样总×500)÷T=7.103×10-3×ΔA

V反总:反应体系总体积,2.6×10-4L;ε:尿酸摩尔消光系数,1.22×104L/mol/cm;d:96孔板光径,0.6cm;V样:加入样本体积,0.01 ml;V样总:加入提取液体积,1ml;T:反应时间,1min;W:样品质量,g;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/ml;500:细胞或细菌总数,500万。

注意事项:

1、正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定,保证吸光值变化在0.01~0.9之间。

2、试剂二加入试剂一后会有部分小颗粒,可以直接使用或者离心后使用,对实验结果基本无影响。

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