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果糖-1,6-二磷酸酶(FBP)检测试剂盒(微量法)
果糖-1,6-二磷酸酶(FBP)检测试剂盒(微量法)图片
包装: 100管/96样
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半岛bd体育手机客户端 介绍

果糖-1,6-二磷酸酶(Fructose 1,6-bispHospHatase,FBP)又称果糖-1,6-二磷酸酯酶,其在糖异生过程和光合作用同化物蔗糖的合成中起关键性的作用。催化1,6-二磷酸果糖和水生成6-磷酸果糖和无机磷。

FBP催化1,6-二磷酸果糖和水,生成6-磷酸果糖和无机磷,在反应体系中添加的磷酸葡萄糖异构酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADpH,测定340nm下NADpH的增加速率,即可计算FBP活性。

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

半岛bd体育手机客户端 组成:

试剂名称 规格 保存条件
提取液 液体100ml×1瓶 2-8℃
试剂一 粉剂×1瓶 2-8℃
试剂二 液体8μL×1瓶 -20℃
试剂三 液体108μL×1瓶 -20℃
试剂四 液体25ml×1瓶 2-8℃

溶液的配制:

1.试剂一:临用前加入20ml试剂四充分溶解待用,用不完的试剂于4℃保存。

2.试剂二:液体置于试剂瓶内EP管中。临用前加入1.1ml蒸馏水充分溶解待用,用不完的试剂分装后-20℃保存,避免反复冻融。

3.试剂三:液体置于试剂瓶内EP管中。临用前加入1.1ml蒸馏水充分溶解待用,用不完的试剂分装后-20℃保存,避免反复冻融。

试验中所需的半岛游戏平台官网入口网址 和试剂:

紫外分光光度计/酶标仪、天平、低温离心机、微量石英比色皿/96孔UV板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰盒、蒸馏水。

操作步骤 (仅供参考) :

一、样品处理理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1.组织:按照质量(g):提取液体积(ml)为 1:5~10的比例(建议称取约 0.1g,加入 1ml提取液)进行冰浴匀浆。于 4℃,8000g,离心 10min,取上清,置冰上待测。

2.细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(ml)为 500~1000:1的比例(建议 500万细胞加入 1ml提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3秒,间隔 7秒,总时间 3min),于 4℃,8000g,离心10min,取上清,置冰上待测。

二、测定步骤

1.分光光度计/酶标仪预热 30min以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。

2.将试剂一 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)预热 10min。

3.操作表:(在微量石英比色皿/96孔 UV板中依次加入下列试剂)。

试剂名称(μL) 测定管 空白管
样本 20 -
提取液 - 20
试剂二 10 10
试剂三 10 10
试剂一 160 160

在微量石英比色皿/96孔 UV板中分别加入上述试剂,充分混匀后于 340nm处测定 10s时的吸光值 A1,迅速置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴或培养箱 5min(酶标仪有控温功能可直接调节温度),拿出迅速擦干测定 310s时的吸光值 A2,计算ΔA测定管=A2测定-A1测定,ΔA空白管=A2空白-A1空白,ΔA=ΔA测定管-ΔA空白管。(空白管只需做 1-2次)三、FBP含量计算

A、按微量石英比色皿计算

1.按蛋白浓度计算

单位的定义:每 mg组织蛋白每分钟生成 1nmol的 NADpH定义为一个酶活力单位。

FBP(U/mg prot)=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷(Cpr×V样)÷T=321.5×ΔA÷Cpr

2.按样本质量计算

单位的定义:每 g组织每分钟生成 1nmol的 NADpH定义为一个酶活力单位。

FBP(U/g质量)=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T=321.5×ΔA÷W

3.按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每 104个细菌或细胞每分钟生成 1nmol的 NADpH定义为一个酶活力单位。

FBP(U/104cell)=ΔA÷(ε×d)×109×V反总÷(V样÷V样总×细胞数量(万个))÷T=321.5×ΔA÷细胞数量(万个)

V反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:NADpH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm; V样:加入样本体积,0.02ml;V样总:加入提取液体积,1ml;T:反应时间,5min;Cpr:样本蛋白质浓度, mg/ml;W:样本质量,g;109:单位换算系数,1mol=109nmol。

B、按 96孔板计算

将上述公式中的 d-1cm改为 d-0.6cm(96孔 UV板光径)进行计算即可

注意事项:

1.当ΔA大于 0.6时,建议将样本稀释后再进行测量。

2.空白管为检测各试剂组分质量的检测孔,正常情况下,变化不超过 0.02。

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