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果胶(Pectin)是构成细胞初生壁和中胶层的主要成分,对细胞起着软化和黏合作用。果胶间以Ca2+桥及其他离子键、氢键、糖苷键、酯键和苯环偶联的方式交联,通过不同的抽提方法可以提取各种形式的果胶,如水溶性果胶(WSP)、离子结合型果胶(ISP)和共价结合果胶(CSP)。 利用带有螯合剂的酸性提取液提取离子结合型果胶(ISP),其在酸性条件下水解生成半乳糖醛酸,后者在硫酸溶液中与咔唑进行缩合反应形成紫红色的化合物,生成物质在530nm处有最大吸收峰。 注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 半岛bd体育手机客户端 内容:
溶液的配制: 1.提取液一:80%乙醇,自备。即将80ml无水乙醇和20ml蒸馏水混合。 2.试剂一:浓硫酸60ml,自备。 3.标准品:10mg半乳糖醛酸。临用前加入0.943ml提取液三,配成50μmol/ml的标准液。 技术指标: 最低检出限:0.0212μmol/ml 线性范围:0.025-2.5μmol/ml 需自备的半岛游戏平台官网入口网址 和用品: 可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、1ml玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、丙酮、浓硫酸、无水乙醇和蒸馏水。 操作步骤: 一、样品处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献) 1.取约0.1g样本,加入1ml提取液一,室温快速匀浆,95℃水浴20min,冷却至室温,4000g 25℃离心10min,弃上清。沉淀加入1.5ml提取液一和丙酮交替各洗2遍(涡旋振荡2min左右,4000g 25℃离心10min,弃上清即可),沉淀即为粗细胞壁,加入1ml提取液二(去除淀粉)浸泡15小时,4000g 25℃离心10min,弃上清,加入1ml提取液三,充分匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清液待测。 二、测定操作 1.分光光度计预热30min以上,调节波长至530nm,分光光度计蒸馏水调零。 2.将50μmol/ml标准液用提取液三稀释为2、1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1μmol/ml的标准溶液备用。 3.操作表:
三、ISP含量的计算 1.标准曲线的绘制: 以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔA测定带入方程得到x(μmol/ml)。 2.离子结合型果胶含量的计算: 离子结合型果胶含量(μmol/g质量)=x×V提取液三÷W =x÷W V提取液三:加入提取液三的体积,1ml;W:样本质量,g。 注意事项: 1.浓硫酸具有强腐蚀性,操作时需特别注意,90℃加热取出后冷却再打开盖子,以防液体飞溅烧伤。建议每次实验冷却时间保持一致。 2.如果测定吸光值超过线性范围吸光值,可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。 |
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