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介绍 注意:正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。 GOGAT主要存在于原核生物、酵母菌及高等植物非绿色组织的前质体中,和谷氨酰胺合成酶(GS)共同构成GS/GOGAT循环,参与氨同化的调控。 GOGAT以NADH为电子供体,催化谷氨酰胺的氨基转移到α-酮戊二酸形成两分子的谷氨酸,NADH在340nm吸光度的下降速率可以反映GOGAT活性大小。 半岛bd体育手机客户端 内容: 提取液:液体60ml×1瓶,4℃保存; 试剂一:液体60ml×1瓶,4℃保存; 试剂二:粉剂×2支,4℃保存; 试剂三:粉剂×2支,4℃保存; 试剂四:粉剂×2支,-20℃保存。 工作液的配制:取试剂二、试剂三、试剂四各一支加入30ml试剂一中溶解。现用现配。可分装后-20℃保存,避免反复冻融。 需自备的半岛游戏平台官网入口网址 和用品: 紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1ml石英比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。 操作步骤: 一、粗酶液提取: 细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(ml)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1ml提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);10000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。 组织:按照组织质量(g):提取液体积(ml)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1ml提取液),进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。 二、测定步骤: 1、紫外分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,光度计蒸馏水调零。 2、工作液提前配置,平衡至室温。 3、样本测定:
三、GOGAT活性计算: (1)按样本蛋白浓度计算:单位的定义:每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol的NADH定义为一个酶活力单位。 GOGAT(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=321.5×ΔA÷Cpr (2)按样本鲜重计算: 单位的定义:每g组织每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。 GOGAT(U/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=321.5×ΔA÷W (3)按细菌或细胞密度计算: 单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。 GOGAT(U/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.643×ΔA V反总:反应体系总体积,10-3L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L/ mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.1ml;V样总:加入提取液体积,1 ml;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/ml; W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。 注意事项: 1、测定期间样本在冰上放置,以免变性和失活。 2、**两个人同时做此实验,一个人比色,一个人计时,以保证实验结果的准确性。 3、当A1大于1.5或者ΔA大于0.6时,建议将样品用蒸馏水稀释后测定,当ΔA过小时,可以延长酶促反应时间(10min 或15min)或者加大加入的样品体积进行测量。 4、由于提取液中含有一定浓度的蛋白(约1mg/ml),所以在测定样品蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。 |
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