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氨基比林-N-去甲基化酶(AND)活性检测试剂盒(微量法)
氨基比林-N-去甲基化酶(AND)活性检测试剂盒(微量法)图片
包装: 100管/48样
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半岛bd体育手机客户端 介绍

细胞色素P450酶是一组在外源物质代谢中,尤其是药物和毒物,具有重要作用的酶系。AND作为P450酶系的重要一员,相当于CYP3A4亚型,与药物的去甲基化反应密切相关。

AND催化氨基比林释放甲醛,通过Nash比色法测定甲醛含量,即可计算出AND活性。

半岛bd体育手机客户端 组成:

试剂一:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加100ml蒸馏水充分溶解。

试剂二:液体×1瓶,4℃保存。

试剂三:粉剂×1管,4℃避光保存。临用前加入1ml无水乙醇,充分溶解。

试剂四:粉×1管,4℃保存。临用前加入0.5ml蒸馏水,充分溶解。

试剂五:粉剂×1瓶,室温保存。临用前加蒸馏水4ml充分溶解。

试剂六:液体×1瓶,室温保存。

试剂七:液×1瓶,4℃保存。

标准液:液体×1瓶,-20℃保存。临用前取1.5mlEP管,加入10μl标准液,加990μl蒸馏水,混匀即为0.05mmol/L标准甲醛溶液,4℃保存。

需自备的半岛游戏平台官网入口网址 和用品:

普通离心机,超速离心机、水浴锅、可调式移液枪、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、蒸馏水、无水乙醇和冰。

操作步骤:

一、粗酶液提取:

1.除去细胞核,线粒体等大分子物质:称约0.5g组织,加入1ml试剂一,冰上充分研磨,10000g 4℃离心30min,取上清液转入超速离心管。

2.粗制微粒体:4℃,100000g,离心60min,弃上清液。

3.除血红蛋白等杂质:向步骤2的沉淀中加1ml试剂一,盖紧后充分震荡溶解,100000g离心30min,弃上清液。

4.最终微粒体:向步骤3的沉淀中加试剂二0.5ml,盖紧后充分震荡溶解,即粗酶液,待测。该待测液需当天使用。

二、AND 活性测定步骤:

1.分光光度计/酶标仪预热 30min,调节波长到 412nm,蒸馏水调零。

2.试剂二置于 37℃水浴中预热 30min。

3.对照管:取 1支 EP管,加入 10μL粗酶液,170μL试剂二,10μL试剂三,10μL蒸馏水,混匀后置于 37℃水浴保温30min;立即加入 35μL试剂五,混匀后置于冰浴中 5min;取出后加入 35μL试剂六,混匀后室温静置 5min;室温8000rpm离心 5min;取新的 EP管,加入 100μL上清液,100μL试剂七,混匀后 60℃水浴10min,然后取出,用冷水冷却 5min,于 412nm测定光吸收,记为 A对照管。

4.测定管:取 1支 EP管,加入 10μL粗酶液,170μL试剂二,10μL试剂三,10μL试剂四,混匀后置于 37℃水浴保温30min;立即加入 35μL试剂五,混匀后置于冰浴中 5min;取出后加入 35μL试剂六,混匀后室温静置 5min;室温8000rpm离心 5min;取 1支新 EP管,加入 100μL上清液,100μL试剂七,混匀后 60℃水浴 10min,然后取出,用冷水冷却5min,于 412nm测定光吸收,记为 A测定管。

5.标准管:取 1支 EP管,加入 100μL标准品,100μL试剂七,混匀后 60℃水浴 10min,然后取出,用冷水冷却 5min,于 412nm测定光吸收,记为 A标准管。注意:每个样品都需要做对照管。

三、AND 活性计算:

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按蛋白浓度计算

活性单位定义:37℃中每分钟每毫克蛋白催化产生 1nmol甲醛为 1个酶活单位。

AND活性(nmol/min/mg prot)=C标准品×V标准品×(A测定管-A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷(Cpr×V样)÷T=45×(A测定管-A对照管)÷A标准管÷Cpr。

(2)按样本质量计算

活性单位定义:37℃中每分钟每克组织催化产生 1nmol甲醛为 1个酶活单位。

AND活性(nmol/min/g鲜重)=C标准品×V标准品×(A测定管-A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷(V样÷V样总×W)÷T=22.5×(A测定管-A对照管)÷A标准管÷W。

C标准品:0.05 mmol/L=50μmol/L;V标准品:100μL=0.0001 L;稀释倍数:V反总÷V上清液=(10+170+10+10+35+35)÷100=2.7; Cpr:粗酶液蛋白质浓度(mg/ml),需要另外测定,建议使用本公司 BCA蛋白质含量测定试剂盒; V样:加入粗酶液体积,10μL=0.01ml;V样总:提取液体积,0.5ml;W:样本质量,g;T:催化反应时间(min),30min。

b.使用 96孔板测定的计算公式如下

(1)按蛋白浓度计算

活性单位定义:37℃中每分钟每毫克蛋白催化产生 1nmol甲醛为 1个酶活单位。

AND活性(nmol/min/mg prot)=C标准品×V标准品×(A测定管-A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷(Cpr×V样)÷T=45×(A测定管-A对照管)÷ A标准管÷ Cpr。

(2)按样本质量计算

活性单位定义:37℃中每分钟每克组织催化产生 1nmol甲醛为 1个酶活单位。

AND活性(nmol/min/g鲜重)=C标准品×V标准品×(A测定管-A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷(V样÷V样总×W)÷T=22.5×(A测定管-A对照管)÷ A标准管÷W。

C标准品:0.05 mmol/L=50μmol/L;V标准品:100μL=0.0001 L;稀释倍数:V反总÷V上清液=(50+850+50+50+175+175)÷500=2.7; Cpr:粗酶液蛋白质浓度(mg/ml),需要另外测定,建议使用本公司 BCA蛋白质含量测定试剂盒; V样:加入粗酶液体积,10μL=0.01ml;V样总:提取液体积,0.5ml; W:样本质量,g ; T:催化反应时间(min),30min。

注意事项:

1.粗酶液需在当日完成测定,如需保存,则向粗酶液提取步骤 3的沉淀中加 0.5ml 20%的甘油,分装后,-80℃保存;

2.试剂三和试剂四需临用前配制,如当天没有用完,4℃避光保存,可用 1周;

3.粗酶液可直接用于蛋白浓度测定,建议用 BCA法测蛋白含量。

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