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β-葡萄糖苷酶(β-GC)活性检测试剂盒(可见分光光度法)
β-葡萄糖苷酶(β-GC)活性检测试剂盒(可见分光光度法)图片
包装: 50管/24样
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半岛bd体育手机客户端 介绍

β-GC(EC 3.2.1.21)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,催化β-糖苷键水解,具有多方面生理作用:在纤维素的糖化作用中,β-GC负责进一步水解纤维素二糖和纤维素寡糖生成葡萄糖;β-GC水解萜烯类香气前驱体,使糖苷键合态变成游离态。从而产生香味;β-GC能够水解植物体内野黑樱苷,释放HCN,从而防止昆虫取食。

β-GC分解对-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷生成对-硝基苯酚,后者在400nm有最大吸收峰,通过测定吸光值升高速率来计算β-GC活性。

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

半岛bd体育手机客户端 组成:

试剂名称 规格 保存条件
提取液 液体50ml×1瓶 4℃
试剂一 粉剂×2瓶 -20℃
试剂二 液体25ml×1瓶 4℃
试剂三 液体80ml×1瓶 4℃
标准品 液体1ml×1支 4℃

溶液的配制:

试剂一:临用前每瓶加入10ml双蒸水,充分溶解备用;用不完的试剂仍-20℃保存;

标准品:5μmol/ml的对硝基苯酚溶液。

需自备的半岛游戏平台官网入口网址 和用品:

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1ml玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1.细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(ml)为500~1000:1的比例(建议1000万细菌或细胞加入1ml提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);15000g 4℃离心20min,取上清,置冰上待测。

2.组织:按照组织质量(g):提取液体积(ml)为1:5~10的比例(建议称取约0.2g组织,加入1ml提取液),进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心20min,取上清,置冰上待测。

二、测定步驟

1.分光光度计预热30min以上,调节波长至400nm,蒸馏水调零。

2.标准样本的准备:取100μL标准液,加入到400μL试剂三中,得到1μmol/ml标准液,十倍稀释到100nmol/ml,用蒸馏水倍比稀释:50、25、12.5、6.25nmol/ml。100、50、25、12.5、6.25、0nmol/ml做标准液。

3.加样表:

试剂名称(μL) 测定管 对照管 标准管
试剂一
400
试剂二 500 500
样本 100 100
迅速混匀,放入37℃准确水浴30min后,立即放入沸水浴中煮沸5min(盖紧,以防止水分散失),流水冷却后充分混匀(以保证浓度不变)
试剂一 400

充分混匀,8000g,4℃,离心5min,取上清液
上清液 500 500
标准液

500
试剂三 1000 1000 1000
充分混匀,室温静置2min后,400nm处测定吸光值A,计算ΔA=A测定管-A对照管。每个测定管需设一个对照管。

三、β- GC活力单位的计算

1.标准曲线建立:根据标准管的浓度(x)和吸光度(减去浓度为0标准管的OD值,y),建立标准曲线。根据标准曲线,将ΔA

(y)带入公式计算样本产物浓度x(nmol/ml)。

2.按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每mg组织蛋白每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

β-GC活力(U/mg prot)=(x×V反总)÷(V样×Cpr)÷T=20x÷Cpr

蛋白浓度需要另外测定。

3.按样本质量计算:

单位的定义:每g组织在每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

β-GC活力(U/g质量) = (x×V反总)÷(W×V样÷V样总)÷T=20x÷W

4.按细菌或细胞数量计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每小时产生1nmol对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。

β-GC活力(U/104cell)=(x×V反总)÷(1000×V样÷V样总)÷T=0.02x Cpr:样本蛋白质浓度,mg/ml;V反总:反应体系总体积,1ml;V样:加入反应体系中样本体积,0.1ml;V样总:加入提取液体积,1ml;W:样本质量,g;1000:细胞或细菌总数,1000万;T:反应时间,0.5h。

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