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β-淀粉酶活性检测试剂盒(可见分光光度法)
β-淀粉酶活性检测试剂盒(可见分光光度法)图片
包装: 50管/24样
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半岛bd体育手机客户端 介绍

淀粉酶负责水解淀粉,主要包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)从淀粉的非还原端切开α-1,4糖苷键,生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖。

还原糖还原3,5-二硝基水杨酸生成棕红色物质。α-淀粉酶不耐酸,β-淀粉酶不耐热。根据上述特性,钝化其中之一,就可测出另一种淀粉酶的活力。

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

半岛bd体育手机客户端 内容:

试剂名称 规格 保存条件
试剂一 液体65ml×1瓶 室温
试剂二 粉剂×1瓶 4℃
标准品 粉剂×1支 4℃

溶液的配制:

1.试剂一:若有黄色晶体析出,需加热溶解后再用。

2.试剂二:临用前加入35ml蒸馏水,置于常温水中并加热至煮沸,期间不断搅拌粉剂至溶解。

3.标准品:10mg无水葡萄糖。临用前加入1ml蒸馏水配制成10mg/ml的标准溶液。

需自备的半岛游戏平台官网入口网址 和用品:

可见分光光度计、恒温水浴锅、离心机、可调式移液器、1ml玻璃比色皿、研钵/匀浆器和蒸馏水。

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

称取约0.1g样本,加入0.8ml蒸馏水,研磨匀浆;将匀浆倒入离心管中,提取液在室温下放置提取15min,每5min振荡1次,使其充分提取;6000g,常温离心10min,取上清液加蒸馏水定容至10ml,摇匀,即淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液1ml,加入4ml双蒸水,摇匀,即为淀粉酶稀释液,用于(α+β)淀粉酶总活力的测定。

二、测定步驟

1.分光光度计预热30min以上,调节波长至540nm,蒸馏水调零。

2.将10mg/ml葡萄糖标准液用蒸馏水稀释为0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/ml的标准溶液。

3.取2支EP管分别加入250μL淀粉酶原液和淀粉酶稀释液,沸水浴5min,分别作为α-淀粉酶对照管和β-淀粉酶对照管使用。

4.按操作表依次加入各试剂:

试剂名称(μL) α-淀粉酶活力测定 总淀粉酶活力测定 标准曲线的测定
试剂名称(μL) 对照管 测定管 对照管 测定管 空白管 标准管
淀粉酶原液 250(煮沸) 250 - - - -
蒸馏水 - - - - 250 -
标准溶液 - - - - - 250
70℃水浴15min左右,冷却
淀粉酶稀释液 - - 250(煮沸) 250 - -
试剂二 - 250 - 250 - -
在40℃恒温水浴中准确保温5min
试剂一 500 500 500 500 500 500
试剂二 250 - 250 - 250 250

混匀,沸水浴10min,在540nm下测定吸光度,从左到右分别记为A1、A2、A3、A4、A5和A6,计算ΔAα=A2-A1,ΔA总=A4-A3,ΔA标准=A6-A5。

三、酶活性计算

1.标准曲线的绘制:以ΔA标准为y轴,以标准溶液浓度为x轴,绘制标准曲线,得到方程y=kx+b。将ΔAα测定带入方程得到x1(U/ml),ΔA总代入方程得到x2(mg/ml)。

2. α-淀粉酶活性:

(1)按照样本质量计算

单位定义:每g组织每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

α-淀粉酶活性(U/g质量)=x1×V样÷(W×V样÷V样总)÷T =2×x1÷W

(2)按照蛋白质含量计算

单位定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。

α-淀粉酶活性(U/mg prot)=x1×V样÷(V样×Cpr)÷T=0.2×x1÷Cpr

3.总淀粉酶活性计算:

(1)按照样本质量计算

单位定义:每g组织每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

总淀粉酶活性 (U/g质量)=5×x2×V样÷(W×V样÷V样总)÷T=10×x2÷W

(2)按照蛋白质含量计算

单位定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

总淀粉酶活性(U/mg prot)=5×x2×V样÷(V样×Cpr)÷T=x2÷Cpr

4.β-淀粉酶活性计算:

(1)按照样本质量计算

单位定义:每g组织在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

β-淀粉酶活性(U/g质量)=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=(10×x2÷W)-(2×x1÷W)=(10×x2-2×x1)÷W

(2)按照蛋白质含量计算

单位定义:每mg组织蛋白在反应体系中每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。

β-淀粉酶活性(U/mg prot)=淀粉酶总活性-α-淀粉酶活性=(x2÷Cpr)-(0.2×x1÷Cpr)

5:总淀粉酶稀释倍数,(4ml+1ml)/1ml=5;V样:加入反应体系中样本体积,0.25ml;V样总:提取液总体积,10ml;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/ml;W:样本质量,g;T:反应时间,5min。

注意事项:

测定的吸光值大于1时,可以对样本进行适当稀释后测定。若吸光值过小,可以浓缩淀粉酶稀释液或者淀粉酶原液。

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