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β-1,3葡萄聚糖(β-1,3-GA)活性检测试剂盒(微量法)
β-1,3葡萄聚糖(β-1,3-GA)活性检测试剂盒(微量法)图片
包装: 100管/48样
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半岛bd体育手机客户端 介绍

β-1,3-GA( EC 3.2.1.73)主要存在植物中,催化β-1,3-葡萄糖苷键水解。在植物染病或处于其他逆境条件下,可诱导细胞大量合成β-1,3-GA,因此β-1,3-GA活性测定广泛应用于植物病理和逆境生理研究。β-1,3-GA水解昆布多糖,内切β-1,3-葡萄糖苷键,产生还原末端,通过测定还原糖生成速率,来计算其酶活性。

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

半岛bd体育手机客户端 组成:

试剂名称 规格 保存条件
提取液 液体100ml×1瓶 4℃
试剂一 粉剂×1瓶 4℃
试剂二 液体30ml×1瓶 4℃
标准品 粉剂×1支 4℃

溶液的配制:

1.试剂一:临用前加3.5ml蒸馏水溶解,用不完的试剂4℃保存;

2.标准品:10mg无水葡萄糖,临用前加入1ml蒸馏水溶解,配制成10mg/ml葡萄糖溶液备用,4℃可保存1周。

需自备的半岛游戏平台官网入口网址 和用品:

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤:

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1.组织:按照组织质量(g):提取液体积(ml)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1ml提取液),进行冰浴匀浆。12000g,4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

2.细菌或细胞:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每500万细菌或细胞加入1ml提取液,超声波破菌碎细或细胞(功率20%,超声3s,间隔10s,重复30次);12000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

二、测定步驟

1.分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至540nm,蒸馏水调零。

2.标准品的准备:将标准品用蒸馏水稀释至1、0.8、0.6、0.4、0.2mg/ml。

3.样本测定,(在1.5ml EP管中依次加入下列试剂)

试剂名称(μL) 测定管 对照管 标准管 空白管
样本 35 35 - -
标准液 - - 35 -
双蒸水 - 35 35 70
试剂一 35 - - -
充分混匀,放入37℃水浴60min
试剂二 230 230 230 230

充分混匀,沸水浴5min(盖紧,防止水分散失),流水冷却,取200μL至微量玻璃比色皿或96孔板中,540nm处记录各管吸光值A,如果吸光值大于2,可以用提取液对样本稀释后测定,ΔA=A测定-A对照。

三、β-1,3-GA活性计算

1.标准曲线的建立:

根据标准管吸光度 x(A标准管-A空白管)和浓度(y,mg/ml)建立标准曲线,将ΔA带入公式中计算出样本中产生的还原糖的含量y值(mg/ml)。

2.β-1,3-GA活性计算:

(1)按蛋白浓度计算单位的定义:每mg组织蛋白每小时产生1mg还原糖定义为一个酶活性单位。

β-1,3-GA(U/mg prot)=(y×V1)÷(V1×Cpr)÷T=y÷Cpr

(2)按样本质量计算单位的定义:每g组织每小时产生1mg还原糖定义为一个酶活性单位。

β-1,3-GA(U/g质量)=(y×V1)÷(W×V1÷V2)÷T=y÷W

(3)按细菌或细胞数量计算单位的定义:每1万个细胞或细菌每小时产生1mg还原糖定义为一个酶活性单位。

β-1,3-GA(U/104cell)=(y×V1)÷(500×V1÷V2)÷T=0.002×y

V1:加入反应体系中样本体积,0.035ml;V2:加入提取液体积,1ml;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/ml;W:样本质量,g;T:反应时间,60min=1h;500:细菌或细胞总数,500万。

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