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尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphosphprylase,UGP,EC 2.7.7.9)在自然界广泛分布。在葡萄糖合成糖原前催化葡萄糖活化,将1-磷酸葡萄糖与UTP分子合成为UDP-葡萄糖(UDPG),UDPG是高等植物和动物中主要活化酶的形式,作为葡萄糖基供体参与糖原、蔗糖、纤维素等的合成代谢。 UGP可逆的催化生成1-磷酸葡萄糖,其在磷酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶作用下将NADP转化为NADPH,UGP活性可以用340nm的吸光值的变化来反应。 注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。 半岛bd体育手机客户端 内容:
溶液的配制: 1.试剂一:临用前加15mL蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融,-20℃保存2周。 2.试剂二:临用前加5mL蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后4℃保存,禁止反复冻融,4℃保存1周。 3.试剂三:临用前加1.4mL蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融,-20℃保存2周。 4.试剂四:临用前每支加1mL蒸馏水充分溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融,-20℃保存2周。 5.工作液的配制:将试剂一:试剂二:试剂三:试剂四:试剂五:试剂六按体积比=600:100:20:40:100:250混合,现用现配。 需自备的半岛游戏平台官网入口网址 和用品: 紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。 操作步骤: 一、样品处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献) 1.组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液)进行冰浴匀浆,然后10000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。 2.细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后10000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。 3.血清等液体:直接检测。 测定操作 1.紫外分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm,蒸馏水调零。 2.操作表:
三、UGP酶活计算 1.按照样本蛋白浓度计算酶活单位定义:每毫克组织蛋白每分钟产生1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。 UGP(U/mg prot)=[ΔA÷(ε×d)×V反总×109]÷(V样×Cpr)÷T=321.54×ΔA÷Cpr 2.按照样本质量计算 酶活单位定义:每克组织每分钟产生1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。 UGP(U/g质量)=[ΔA÷(ε×d)×V反总×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=321.54×ΔA÷W 3.按照细胞数量计算酶活单位定义:每104个细胞每分钟产生1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。 UGP(U/104cell)=[ΔA÷(ε×d)×V反总×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.643×ΔA 4.按照液体体积计算酶活单位定义:每毫升液体每分钟产生1nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。 UGP(U/mL)=[ΔA÷(ε×d)×V反总×109]÷V样÷T=321.54×ΔA V反总:反应体系总体积,1×10-3L;ε:NADPH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.1mL;V样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,5min;Cpr:样本蛋白质浓度, mg/mL;W:样本质量,g ;500:细胞或细菌总数,500万;109:单位换算系数,1mol=109nmol。 注意事项: 1.空白管为检测各试剂组分质量的检测孔,正常情况下,变化不超过0.01。 2.ΔA大于0.6或者A2测定大于1.2时,建议将样本稀释后再进行测定。当ΔA小于0.01时,可以延长反应时间(5min或10min)来测定。 |
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