注意:正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

SP(EC 2.4.1.7)主要存在于微生物和植物中，裂解葡萄糖苷键，催化葡萄糖基转移到果糖、木糖、半乳糖和鼠李糖等，合成相应的葡萄糖基低聚糖。此外，SP还能催化氢醌合成熊果苷，具有极强的美白效果，在化妆品工业中具有重要应用。

测定原理

SP能够以磷酸为受体，催化蔗糖产生 1-磷酸葡萄糖，在葡萄糖磷酸变位酶催化下变位为 6-磷酸葡萄糖，在 6-磷酸葡萄糖脱氢酶作用下还原 NADP+生成 NADpH，导致 340nm光吸收值增加。测定 340nm吸光度增加速率，即可计算 SP活性。

自备实验用品及半岛游戏平台官网入口网址

天平、低温离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计、1 ml石英比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配制

提取液:液体 50ml×1瓶，4℃保存。

缓冲液:液体 40ml×1瓶，4℃保存。

试剂一:液体 25ml×1瓶，4℃保存。

试剂二:液体 2ml×1支，4℃保存。

试剂三:液体 1ml×1支，4℃保存。

试剂四:粉剂 1瓶，-20℃避光保存，临用前加 5ml双蒸水溶解。

试剂五:粉剂 1瓶，-20℃避光保存，临用前加 5ml双蒸水溶解。

试剂六:粉剂 1瓶，-20℃避光保存，临用前加 10ml双蒸水溶解。

试剂七:粉剂 1瓶，-20℃避光保存，临用前加 10ml双蒸水溶解。

粗酶液提取

1.组织:按照组织质量(g):提取液体积(ml)为 1:5～10的比例(建议称取约 0.1g组织，加入 1ml提取液)进行冰浴匀浆，然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清待测。

2.细菌、真菌:按照细胞数量(104个):提取液体积(ml)为 500～1000:1的比例(建议 500万细胞加入 1ml提取液)，冰浴超声波破碎细胞(功率 300w，超声 3秒，间隔 7秒，总时间 3min)；然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

测定操作表

	对照管	测定管
缓冲液(μL)	850	650
试剂一(μL)	500	500
试剂二(μL)	30	30
试剂三(μL)	20	20
试剂四(μL)	100	100
试剂五(μL)	100	100
试剂六(μL)	200	200
试剂七(μL)	200	200
混匀，37℃水浴预热 5min
样本(μL)		200
迅速混匀，于 1ml石英比色皿，对照管调零，测定 340nm的初始值 A1，测定完立即放入37℃水浴准确反应 2min，迅速测定 340nm吸光值 A2，△A= A2- A1。

SP活性计算公式

1.按照蛋白浓度计算

酶活定义:37℃，pH6.8时，每毫克蛋白质每分钟催化产生 1nmol NADpH为一个酶活单位。

SP活性(nmol/min/mg prot)=△A÷(ε×d)×V反总÷V样÷Cpr÷T=804×△A÷Cpr

2.按照样本质量计算

酶活定义:37℃，pH6.8时，每克样本每分钟催化产生 1nmol NADpH为一个酶活单位。

SP活性(nmol/min/g鲜重)= △A÷(ε×d)×V反总÷(V样÷V样总×W)÷T=804×△A÷W

3.按照细胞数量计算

酶活定义:37℃，pH6.8时，每 10⁴个细胞每分钟催化产生 1nmol NADpH为一个酶活单位。

SP活性(nmol/min/104 cell)= △A÷(ε×d) ×V反总÷(V样÷V样总×细胞数量(万个))÷T=804×△A÷细胞数量(万个)

ε :NADpH摩尔消光系数，6220 L/mol/cm；d:比色皿光径，1cm；V反总:反应体系总体积，2ml；V样:反应体系中样本体积，0.2ml；W:样本质量，g；Cpr:蛋白浓度，mg/ml；T:反应时间，2min

注意事项

1.粉剂-20℃保存，配制好的试剂 3天内使用完。

2.可选用 BCA法测定蛋白含量试剂盒测定蛋白含量。