正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

蔗糖是源(叶片等)光合产物向“库”器官运输的主要形态。蔗糖合成酶(Sucrose Synthase, EC 2.4.1.13)是双向反应酶，既可催化蔗糖合成又可催化蔗糖分解，是蔗糖代谢的关键酶之一。研究其合成方向 SS-Ⅱ的活性对于植物蔗糖合成具有重要意义。

测定原理

SS-Ⅱ催化游离果糖与葡萄糖供体 UDPG反应生成蔗糖，蔗糖与间苯二酚反应可呈现颜色变化，在 480nm下有特征吸收峰，酶活力大小与颜色的深浅成正比。

需自备的半岛游戏平台官网入口网址 和用品

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、离心机、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰

试剂的组成和配制

提取液：液体 100ml×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体 2.5ml×1瓶，-20℃保存；

试剂二：1000μg/ml蔗糖溶液 10ml×1瓶，4℃保存；

试剂三：液体 2ml×1瓶，4℃保存

试剂四：液体 25ml×1瓶，4℃保存；

试剂五：液体 6ml×1瓶，4℃保存；

样品测定的准备：

按照组织质量(g)：提取液体积(ml)为 1：5～10的比例(建议称取约 0.1g组织，加入 1ml提取液)，进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤

1、分光光度计或酶标仪预热 30min以上，调节波长至 480nm，蒸馏水调零。

2、样本测定，(在 EP管中依次加入下列试剂)：

试剂名称(μL)	测定管	对照管	标准管	空白管
样本	10	10
蒸馏水		45	45	55
试剂二			10
试剂一	45

混匀，25℃准确水浴 10min

试剂三

15

15

15

15

沸水浴中煮沸 10min左右(盖紧，以防止水分散失)，冷却

试剂四	210	210	210	210
试剂五	60	60	60	60

混匀，沸水浴 30min，冷却后，取 200μL至微量石英比色皿或 96孔板中，480nm下测定各管吸光值。标准管和空白管只要做一管。每个测定管需要设一个对照管。

SS-Ⅱ活性计算

1、按照蛋白浓度计算

单位定义：每 mg组织蛋白每分钟催化产生 1μg蔗糖定义为一个酶活力单位。

SS-Ⅱ活性(μg/min/mg prot)= C标准管×V₁×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷(V₁×Cpr)÷T=100×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷Cpr

2、按照样本鲜重计算

单位定义：每 g组织每分钟催化产生 1μg蔗糖定义为一个酶活力单位。

SS-Ⅱ活性(μg/min/g鲜重) = C标准管×V₁×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷(W×V₁÷V₂)÷T=100×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷W

C标准管：标准管浓度，1000μg/ml；V₁：加入反应体系中样本体积，0.01ml； V₂：加入提取液体积，1ml；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本鲜重，g；T ：反应时间：10min。