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胞浆异柠檬酸脱氢酶(ICDHc)测试盒(微量法)
胞浆异柠檬酸脱氢酶(ICDHc)测试盒(微量法)图片
货号: ICDHC-1-Y
包装: 100管/96样
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货号: ICDHC-1-Y
半岛bd体育手机客户端 介绍

正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

ICDHc(EC 1.1.1.42)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,催化异柠檬酸脱氢脱羧生成 α-酮戊二酸,同时还原 NADP+生成 NADpH。ICDHc是细胞质中除了磷酸戊糖途径外又一种 NADpH重要来源,在逆境中该酶活性通常会发生显著变化。

测定原理:

利用 ICDHc催化 NADP+还原成 NADpH反应,在 340 nm下测定 NADpH浓度的增加。

所需的半岛游戏平台官网入口网址 和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

提取液:液体 100ml×1瓶,4℃保存;

试剂一:液体 19 ml×1瓶,4℃保存;

试剂二:粉剂×1瓶,4℃保存;

试剂三:粉剂×1瓶,-20℃保存;

样本的前处理:

1、细菌、细胞或组织样品的制备:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(ml)为 500~1000:1的比例(建议 500万细菌或细胞加入 1ml提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g):提取液体积(ml)为 1:5~10的比例(建议称取约 0.1g组织,加入 1ml提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2、血清(浆)样品:直接检测。

测定步骤:

1、分光光度计或酶标仪预热 30min以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。

2、将试剂二和试剂三转移至试剂一中充分溶解;在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 10min以上;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

3、在微量石英比色皿或 96孔板中加入 10μL样本和 190μL试剂一,混匀后立即记录 340nm处 20s后吸光值 A1和 2min20s后的吸光值 A2,计算 ΔA=A2-A1

注意事项:

1、若 A2-A1大于 0.5,需将酶液用提取液稀释,使 A2-A1小于 0.5,可提高检测灵敏度。

计算公式中乘以相应稀释倍数。

2、若 A2-A1小于 0.005,可延长反应时间到 5min或 10min。

ICDHc活力单位的计算:

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血清(浆)ICDHc活力的计算:

单位的定义:每 ml血清(浆)每分钟生成 1 nmol NADpH定义为一个酶活力单位。

ICDHc(nmol/min/ml)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=1608×ΔA

2、组织、细菌或细胞中 ICDHc活力的计算:

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADpH定义为一个酶活力单位。

ICDHc(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=1608×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g组织每分钟生成 1 nmol NADpH定义为一个酶活力单位。

ICDHc(nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总)÷T=1608×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每 1万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol的 NADpH定义为一个酶活力单位。

ICDHc(nmol/min/104)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=3.216×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:NADpH摩尔消光系数,6.22×103L/ mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.01 ml;V样总:加入提取液体积,1 ml;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/ml;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

b.用 96孔板测定的计算公式如下

1、血清(浆)ICDHc活力的计算:

单位的定义:每 ml血清(浆)每分钟生成 1 nmol NADpH定义为一个酶活力单位。

ICDHc(nmol/min/ml)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷V样÷T=3216×ΔA

2、组织、细菌或细胞中 ICDHc活力的计算:

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADpH定义为一个酶活力单位。

ICDHc(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=3216×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g组织每分钟生成 1 nmol NADpH定义为一个酶活力单位。

ICDHc(nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=3216×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每 1万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol的 NADpH定义为一个酶活力单位。

ICDHc(nmol/min/104)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=6.432×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:NADpH摩尔消光系数,6.22×103L/ mol/cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.01 ml;V样总:加入提取液体积,1 ml;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/ml;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

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