正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

HepHaestin (HP)作为铜蓝蛋白的同系物,是近年来发现的铁转运蛋白亚铁氧化酶，HP属亚铁氧化酶家族成员,具有亚铁氧化酶的活性,参与体内铁代谢。HP的表达可受铁、铜及锌等金属离子的调节。HP催化 Fe²⁺氧化生成 Fe³⁺，在介导铁的跨膜转运中有重要作用。

测定原理：

HP催化 Fe²⁺氧化为 Fe³⁺，Fe²⁺和 ferrozine反应显色，在 560 nm下有特征吸光值。通过测定Fe²⁺的减少速率可测得亚铁氧化酶的活性。

自备用品：

酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体 60 ml×1瓶，4℃保存；

试剂二：液体 1.5 ml×1瓶，4℃保存；

试剂三：液体 11 ml×1瓶，4℃避光保存。

粗酶液提取：

按照组织质量(g)：水(ml)为 1：5～10的比例(建议称取约 0.1g组织，加入 1ml蒸馏水)，进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1.酶标仪预热 30 min以上，调节波长至 560 nm。

2.在 96孔板中加入下列试剂

试剂名称(μL)	测定管	对照管
试剂一	50	50
试剂二	10	10
样本	10	10
蒸馏水	30	30
试剂三	混匀，40℃静置 30 min	100
试剂三	100
混匀，立即测定 A对照和 A测定，ΔA=A对照-A测定。(每个测定管需设一个对照管)

HP活性计算:

标准曲线：y = 8.2135x - 0.0006，R²= 0.9998；(x为标准品浓度，μmol/ml；y为吸光值 ΔA)

(1)按样本质量计算

单位定义：每 g样本每分钟氧化 1nmol Fe²⁺定义为一个酶活力单位。

HP(nmol/min/g鲜重)=(△A+0.0006)÷8.2135×V总÷T÷(W×V样÷V样总)×1000= 40.58×(△A+0.0006)÷W

(2)按样本蛋白浓度计算

单位定义：每 mg蛋白每分钟氧化 1nmol Fe²⁺定义为一个酶活力单位。

HP(nmol/min/mg prot)=(△A+0.0006)÷8.2135×V总÷T÷(Cpr×V样)= 40.58×(△A+0.0006)÷Cpr

V总：反应体系体积，0.1 ml；V样：加入样本体积 0.01 ml；V样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，30min；W：样品质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/ml；1000，μmol到 nmol的转换系数。