半岛bd体育手机客户端 介绍
正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定 测定意义: 线粒体复合体Ⅱ又称琥珀酸-辅酶 Q还原酶,广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,催化琥珀酸氧化生成延胡索酸,同时辅基 FAD还原为 FADH2,后者进一步还原氧化型辅酶 Q生成还原型辅酶 Q,是呼吸电子传递链的支路。 测定原理: 复合体Ⅱ的催化产物还原型辅酶 Q可进一步还原 2,6-二氯吲哚酚,2,6-二氯吲哚酚在 605nm有特征吸收峰,通过检测 2,6-二氯吲哚酚的减少速率来计算该酶活性。 需自备的半岛游戏平台官网入口网址 和用品: 可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。 试剂组成和配制: 试剂一:液体 100ml×1瓶,-20℃保存; 试剂二:液体 20ml×1瓶,-20℃保存; 试剂三:液体 1.5ml×1支,-20℃保存; 试剂四:液体 25ml×1瓶,4℃保存; 试剂五:粉剂×1支,-20℃保存; 试剂六:液体 2.5ml×1瓶,4℃保存; 样本的前处理: 组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离: 1、准确称取 0.1g组织或收集 500万细胞,加入 1ml试剂一和 10uL试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。 2、将匀浆 600g,4℃离心 5min。 3、弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心 10min。 4、上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅱ(此步可选做)。 5、步骤④中的沉淀即为线粒体,加入 200uL试剂二和 2uL试剂三,超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10秒,重复 30次),用于复合体Ⅱ酶活性测定。 测定步骤: 1、分光光度计或酶标仪预热 30min以上,调节波长至 605nm,蒸馏水调零。 2、样本测定 (1)工作液的配制:临用前把试剂五转移到试剂四中混合溶解,置于 37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育 5min;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。 (2)在微量石英比色皿或 96孔板中加入 10μL样本、25μL试剂六和 200μL工作液,立即混匀,记录 605nm处初始吸光值 A1和 2min后的吸光值 A2,计算 ΔA=A1-A2。 复合体Ⅱ活力单位的计算: a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下: (1)按样本蛋白浓度计算 单位的定义:每 mg组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。 复合体Ⅱ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=559×ΔA÷Cpr 此法需要自行测定样本蛋白质浓度。 (2)按样本鲜重计算 单位的定义:每 g组织每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。 复合体 Ⅱ活力 (nmol/min/g鲜重 )=[ΔA×V反总÷ ( ε×d ) ×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=113×ΔA÷W (3)按细菌或细胞密度计算 单位的定义:每 1万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。 复合体 Ⅱ活力 (nmol/min/104cell)=[ΔA×V反总÷ ( ε×d ) ×109]÷(500×V样÷V样总 )÷T=0.226×ΔA V反总:反应体系总体积,2.35×10-4L;ε:2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数,2.1×104L/ mol/cm; d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.01 ml;V样总:加入提取液体积,0.202 ml; T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/ml;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。 b.使用 96孔板测定的计算公式如下: (1)按样本蛋白浓度计算 单位的定义:每 mg组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。 复合体Ⅱ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样)÷T=1118×ΔA÷Cpr 此法需要自行测定样本蛋白质浓度。 (2)按样本鲜重计算 单位的定义:每 g组织每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。 复合体 Ⅱ活力 (nmol/min/g鲜重 )=[ΔA×V反总÷ ( ε×d ) ×109]÷(W ×V样÷V样总 )÷T=226×ΔA÷W (3)按细菌或细胞密度计算 单位的定义:每 1万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定义为一个酶活力单位。 复合体Ⅱ活力(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.452×ΔA V反总:反应体系总体积,2.35×10-4L;ε:2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数,2.1×104L/ mol/cm; d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.01 ml;V样总:加入提取液体积,0.202 ml;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/ml;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。 |
相关半岛bd体育手机客户端
|