注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

维生素 B₆(Vitamin B₆)又称吡哆素，其包括吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺，在体内以磷酸酯的形式存在，是一种水溶性维生素，在细胞中参与多种蛋白质和氨基酸的代谢，对生物体具有极其重要的作用。

测定原理

VB₆与 4-氨基安替比林在强氧化剂作用下生成稳定的黄色化合物，在 390nm有特征吸收峰。

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天平、研钵、离心机、可见分光光度计、恒温水浴锅、1 mL玻璃比色皿、蒸馏水。

试剂组成和配制

提取液：液体 35mL×1瓶，4℃保存。

试剂一：液体 1mL×1瓶，4℃保存。

试剂二：液体 12mL×1瓶，4℃保存。

试剂三：液体 18mL×1瓶，4℃避光保存。

试剂四：液体 18mL×1瓶，4℃避光保存。

样本处理

1.组织：将样品磨碎，按照质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5～10的比例(建议称取约0.1g，加入 0.6mL提取液)加入提取液，60℃浸提 30min，加蒸馏水 0.4mL，混匀后于25℃，16000rpm离心 10min，取上清测定(动物组织等蛋白含量较高的样本建议离心20-30分钟)。

2.细胞：按照细胞数量(10⁴个)：提取液体积(mL)为 500～1000：1的比例(建议 500万细胞加入 0.6mL提取液)，冰浴超声波破碎细胞(功率 300w，超声 3秒，间隔 7秒，总时间 3min)；加蒸馏水 0.4mL，混匀后于 25℃，16000rpm离心10min，取上清测定。

3.血清：直接测定。

测定操作

	空白管	测定管
样品(μL)		200
试剂一(μL)	200
试剂二(μL)	200	200
试剂三(μL)	300	300
试剂四(μL)	300	300
充分混匀，25℃反应 20min，于 1mL玻璃比色皿，蒸馏水调零，测定 390nm处吸光值，记为 A空白管和 A测定管，△A=A测定管-A空白管。空白管只要做一管。

计算公式

标准曲线：y = 0.3635x+0.0205，R²= 0.9986

1.按照蛋白含量计算

VB₆含量(μg/mg prot)=(△A - 0.0205)÷ 0.3635×V反总÷(V样×Cpr)= 13.76×(△A - 0.0205)÷ Cpr

2.按照样本质量计算

VB₆含量(μg/g)=(△A - 0.0205)÷ 0.36359 ×V反总÷(V样×W÷V样总)= 13.76×(△A - 0.0205)÷ W

3.按照细胞数量计算

VB₆含量(μg/10⁴cell)=(△A - 0.0205)÷ 0.3635×V反总÷(V样×细胞数量÷V样总)= 13.76×(△A - 0.0205)÷细胞数量

4.按照液体体积计算

VB₆含量(μg/mL)=(△A - 0.0205)÷ 0.3635×V反总÷V样=13.76×(△A - 0.0205)

V反总：反应总体积，1mL；：V样：加入样本体积，0.2mL；V样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g

注意事项

1.若测定结果中吸光值超过 1，请将样本稀释后进行测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。

2.蛋白浓度较高的样品，比如动物组织，若显色完成后有沉淀产生，将样本稀释后再测定，在计算公式中乘以稀释倍数。

3.显色完成后立即进行测定。