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维生素B1测试盒(微量法)
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货号: VB1-1-G
包装: 100管/96样
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货号: VB1-1-G
半岛bd体育手机客户端 介绍

注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

维生素 B1(Vitamin B1)是构成脱羧辅酶的主要成分,参与细胞代谢中的三羧酸循环,是维持机体正常代谢必须的水溶性维生素,在生物体能量代谢中有重要的作用。

测定原理

VB1在碱性条件下还原铁氰化钾生成亚铁氰化钾,亚铁氰化钾与 Fe3+在弱酸条件下生成普鲁士蓝,在 704nm有特征吸收峰。

自备实验用品及半岛游戏平台官网入口网址

天平、研钵、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅、蒸馏水。

试剂组成和配制

提取液:液体 70mL×1瓶,4℃保存。

试剂一:液体 1mL×1瓶,4℃保存。

试剂二:液体 2mL×1支,4℃保存。

试剂三:液体 2mL×1瓶,4℃避光保存。

试剂四:液体 5mL×1瓶,4℃保存。

试剂五:液体 3mL×1瓶,4℃避光保存。

样本处理

1.组织:将样品磨碎,按照质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10的比例(建议称取约0.1g,加入 0.6mL提取液)加入提取液,60℃浸提 30min,加蒸馏水 0.4mL,混匀后于25℃,16000rpm离心 10min,取上清测定(动物组织等蛋白含量较高的样本建议离心20-30min)。

2.细胞:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1的比例(建议 500万细胞加入 0.6mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3秒,间隔 7秒,总时间 3min);加蒸馏水 0.4mL,混匀后于 25℃,16000rpm离心10min,取上清测定。

3.血清:直接测定。

测定操作


空白管 测定管
样品(μL)
20
试剂一(μL) 20
试剂二(μL) 16 16
试剂三(μL) 20 20
充分混匀,80℃反应 10min
提取液(μL) 16 16
试剂四(μL) 44 44
试剂五(μL) 24 24
H2O(μL) 60 60
充分混匀,静置 20min,于微量石英比色皿/96孔板,蒸馏水调零,测定 704nm处吸光值,记为 A空白管和 A测定管,△A=A测定管-A空白管。

计算公式

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线:y = 0.017x+0.0031,R2= 0.9991;x为标准品浓度:μg/mL;y为△A(A测定管-A空白管)

1.按照蛋白含量计算

VB1含量(μg/mg prot)=(△A-0.0031)÷ 0.017÷Cpr= 58.8×(△A-0.0031)÷ Cpr

2.按照样本质量计算

VB1含量(μg/g鲜重)=(△A-0.0031)÷ 0.017÷(W÷V样总)= 58.8×(△A-0.0031)÷ W

3.按照细胞数量计算

VB1含量(μg/104cell)=(△A-0.0031)÷ 0.017÷(细胞数量÷V样总)= 58.8×(△A-0.0031)÷细胞数量

4.按照液体体积计算

VB1含量(μg/mL)=(△A-0.0031)÷ 0.017= 58.8×(△A-0.0031)

V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g

b.用 96孔板测定的计算公式如下

标准曲线:y = 0.0085x +0.0031,R2= 0.9991;x为标准品浓度:μg/mL;y为△A(A测定管-A空白管)

1.按照蛋白含量计算

VB1含量(μg/mg prot)=(△A -0.0031)÷ 0.0085÷Cpr= 117.65×(△A-0.0031)÷ Cpr

2.按照样本质量计算

VB1含量(μg/g鲜重)=(△A-0.0031))÷ 0.0085÷(W÷V样总)= 117.65×(△A-0.0031)÷ W

3.按照细胞数量计算

VB1含量(μg/104cell)=(△A-0.0031)÷ 0.0085÷(细胞数量÷V样总)= 117.65×(△A-0.0031)÷细胞数量

4.按照液体体积计算

VB1含量(μg/mL)=(△A-0.0031)÷ 0.0085= 117.65×(△A-0.0031)

V样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g

注意事项

1.若测定结果中吸光值超过 2,请将样本稀释后进行测定,并在计算公式中乘以稀释倍数。

2.蛋白浓度较高的样品,比如动物组织,若显色完成后有沉淀产生,将样本稀释后再重新测定,并在计算公式中乘以稀释倍数。

3.显色完成后立即进行测定。

4.标准曲线线性范围为 0.1-10μg/mL。

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