正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义９�/span>

碳酸酐酶(Carbonic Anhydrase，CA)是一种含锌金属酶，迄今在哺乳动物体内已发现至少有11种同工酶，它们的结构、分布、性质各异，多与各种上皮细胞泌H-和碳酸氢盐有关，通过催化CO2水化反应及某些脂、醛类水化反应，参与多种离子交换 ，维持机体内环境稳态、�/span>

测定原理９�/span>

碳酸酐酶具有酯酶活性，可催化乙酸对硝基苯酯反应生成对硝基苯酚，通过检� 405nm处吸光值上升速率反映碳酸酐酶活性、�/span>

需自备的仪器和用品９�/span>

分光光度计、水浴锅、可调式移液器�?mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水、�/span>

试剂的组成和配制９�/span>

提取液：液体 60mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液� 40mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1瓶，-20℃避光保存；临用前加� 12mL试剂三，充分溶解待用，用不完的试剂继�?20℃避光保存、�/span>

试剂三：液体 15mL×1瓶，4℃保存、�/span>

样品测定的准备：

1、细菌或细胞的处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数�?10⁴�?：提取液体积(mL)� 500�?000�?的比�?建议 500万细菌或细胞加入 1mL提取�?，超声波破碎细菌或细�?冰浴，功� 20%� 200W，超� 3S，间� 10S，重�?0�?�?000g�?℃离� 10min，取上清，置冰上待测、�/span>

2、组织的处理：按照组织质�?g)：提取液体积(mL)� 1�?�?0的比�?建议称取� 0.1g组织，加� 1mL提取�?，冰浴中匀浆�?000g �?℃离� 10min，取上清，置冰上待测、�/span>

测定步骤

1、分光光度计预热 30min，调节波长至 405nm，蒸馏水调零、�/span>

2、试剂一、试剂二提前 25℃预� 10min、�/span>

3、取 1mL玻璃比色皿，依次加入 100μL样本上清�?00μL试剂一，最后加� 200μL试剂二。立刻混匀，测� 405nm� 3min处吸光� A1� 6min处吸光� A2，ΔA=A2-A1

CA活力计算９�/span>

标准条件下测定回归方程为 y = 2.0848x + 0.001，R²= 0.9994；x为标准品浓度(μmol/mL)，y为吸光值、�/span>

1、按照蛋白浓度计箖�/span>

单位的定义：� mg组织蛋白每分钟催化产� 1nmol对硝基酚定义为一个酶活力单位、�/span>

CA活�?nmol/min/mg prot)=(ΔA-0.001)÷2.0848×V样�?V样×Cpr)÷T×10⁰⁰=159.89×(ΔA-0.001)÷Cpr

2、按样本鲜重计算

单位的定义：� g组织每分钟催化产� 1nmol对硝基酚定义为一个酶活力单位、�/span>

CA活�?nmol/min/g鲜重)=(ΔA-0.001)÷2.0848×V样�?W ×V样÷V样�?÷T×10⁰⁰=159.89×(ΔA-0.001)÷W

3、按细菌或细胞密度计箖�/span>

单位的定义：� 1万个细菌或细胞每分钟催化产生 1nmol对硝基酚定义为一个酶活力单位、�/span>

CA活�?nmol/min/10⁴cell)=(ΔA-0.001)÷2.0848×V样�?500 ×V样÷V样�?÷T×10⁰⁰=0.319×(ΔA-0.001)

V样：加入样本体积�?.1mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度� mg/mL；W：样本质量，g�?00：细菌或细胞总数�?00万；T：反应时间，3min�?000，μmol� nmol的换算系数、�/span>