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碳酸酐酶(CA)测试盒(微量法)
碳酸酐酶(CA)测试盒(微量法)图片
货号: CAS-1-W
包装: 100管/96样
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货号: CAS-1-W
半岛bd体育手机客户端 介绍

正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

碳酸酐酶(Carbonic Anhydrase,CA)是一种含锌金属酶,迄今在哺乳动物体内已发现至少有11种同工酶,它们的结构、分布、性质各异,多与各种上皮细胞泌H-和碳酸氢盐有关,通过催化CO2水化反应及某些脂、醛类水化反应,参与多种离子交换 ,维持机体内环境稳态。

测定原理:

碳酸酐酶具有酯酶活性,可催化乙酸对硝基苯酯反应生成对硝基苯酚,通过检测 405nm处吸光值上升速率反映碳酸酐酶活性。

需自备的半岛游戏平台官网入口网址 和用品:

酶标仪、水浴锅、可调式移液器、96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

提取液:液体 100mL×1瓶,4℃保存;

试剂一:液体 20mL×1瓶,4℃保存;

试剂二:粉剂×1瓶,-20℃避光保存;临用前加入 5mL试剂三,充分溶解待用,用不完的试剂继续-20℃避光保存。

试剂三:液体 6mL×1瓶,4℃保存。

样品测定的准备:

1、细菌或细胞的处理:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1的比例(建议 500万细菌或细胞加入 1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3S,间隔 10S,重复30次);8000g,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2、组织的处理:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10的比例(建议称取约 0.1g组织,加入 1mL提取液),冰浴中匀浆。8000g ,4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤

1、酶标仪预热 30min,调节波长至 405nm。

2、试剂一、试剂二提前 25℃预热 10min。

3、取 96孔板,依次加入 20μL样本上清,140μL试剂一,最后加入 40μL试剂二。立刻混匀,测定 405nm下 3min处吸光值 A1与 6min处吸光值 A2,ΔA=A2-A1

CA活力计算:

标准条件下测定回归方程为 y = 1.0424x + 0.001,R2= 0.9994;x为标准品浓度(μmol/mL),y为吸光值。

1、按照蛋白浓度计算

单位的定义:每 mg组织蛋白每分钟催化产生 1nmol对硝基酚定义为一个酶活力单位。

CA活性(nmol/min/mg prot)=(ΔA-0.001)÷1.0424×V样÷(V样×Cpr)÷T×1000=319.77×(ΔA-0.001)÷Cpr

2、按样本鲜重计算

单位的定义:每 g组织每分钟催化产生 1nmol对硝基酚定义为一个酶活力单位。

CA活性(nmol/min/g鲜重)=(ΔA-0.001)÷1.0424×V样÷(W ×V样÷V样总)÷T×1000=319.77×(ΔA-0.001)÷W

3、按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每 1万个细菌或细胞每分钟催化产生 1nmol对硝基酚定义为一个酶活力单位。

CA活性(nmol/min/104cell)=(ΔA-0.001)÷1.0424×V样÷(500 ×V样÷V样总)÷T×1000=0.639×(ΔA-0.001)

V样:加入样本体积:0.02mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;Cpr:样本蛋白质浓度, mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万;T:反应时间,3min;1000,μmol到 nmol的换算系数。

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