正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

蔗糖转化酶(Invertase，Ivr)催化蔗糖不可逆地分解为果糖和葡萄糖，是高等植物蔗糖代谢关键酶之一。根据最适 pH，Ivr分为酸性转化酶(AI)和中性转化酶(NI)两种类型。

AI的最适 pH为 3～5。AI分为可溶性 AI(S-AI)和细胞壁不溶性 AI(B-AI)两种类型。 B-AI存在于细胞间隙并结合在细胞壁上，主要参与韧皮部质外体卸载时蔗糖的分解，以维持库源之间蔗糖的浓度。

测定原理：

B-AI催化蔗糖降解产生还原糖，进一步与 3,5－二硝基水杨酸反应，生成棕红色氨基化合物，在 510nm有特征光吸收，在一定范围内 510nm光吸收增加速率与 B-AI活性成正比。

自备用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液 1：液体 100mL×1瓶，4℃保存；

提取液 2：液体 100mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体 20mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入 10mL试剂一充分溶解备用；用不完的试剂 4℃保存；

试剂三：液体 15mL×1瓶，4℃保存；

粗酶液提取：

按照组织质量(g)：提取液 1体积(mL)为 1：5～10的比例(建议称取约 0.1g组织，加入 1mL提取液 1)，进行冰浴匀浆。12000g 4℃离心 10min，弃上清，沉淀中加入 1mL蒸馏水，充分震荡混匀，12000g 4℃离心 10min，弃上清，沉淀中加入 1mL提取液 2充分混匀，4℃浸提过夜，12000g 4℃离心 20min，取上清置冰上待测。

测定步骤和加样表：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min以上，调节波长至 510nm，蒸馏水调零。

2、样本测定，(在 EP管中依次加入下列试剂)：

试剂名称(μL)	测定管	对照管
样本	50	50
试剂一		200
试剂二	200
混匀， 37℃准确水浴 30min后，95℃水浴 10min(盖紧，以防水分散失)，流水冷却后充分混匀(以保证浓度不变)
试剂三	125	125

混匀，95℃水浴 10min(盖紧，以防止水分散失)，流水冷却后充分混匀，取 200μL至微量石英比色皿或 96孔板中， 510nm处记录各管吸光值 A，如果吸光值大于 2，可以用蒸馏水稀释后测定(计算公式中乘以相应稀释倍数)，ΔA=A测定-A对照。每个测定管设一个对照管。

B-AI活性计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准条件下测定的回归方程为 y = 0.0016x -0.001；x为标准品浓度(μg/mL)，y为吸光值。

(1)按蛋白浓度计算：

单位的定义：37℃每 mg蛋白每分钟产生 1μg还原糖定义为一个酶活性单位。

B-AI活性(μg/min/mg prot)＝[(ΔA +0.001)÷0.0016×V1]÷(V1×Cpr )÷T=20.8×(ΔA +0.001)÷Cpr

(2)按鲜重计算：

单位的定义：37℃每 g组织每分钟产生 1μg还原糖定义为一个酶活性单位。

B-AI活性(μg/min/g鲜重)＝[(ΔA +0.001)÷0.0016×V1]÷(W×V1÷V2)÷T=20.8×(ΔA +0.001)÷W

V1：加入反应体系中样本体积，0.05mL；V2：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，30min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g。

b.用 96孔板测定的计算公式如下

标准条件下测定的回归方程为 y = 0.0008x -0.001；x为标准品浓度(μg/mL)，y为吸光值。

(1)按蛋白浓度计算：

单位的定义：37℃每 mg蛋白每分钟产生 1μg还原糖定义为一个酶活性单位。

B-AI活性(μg/min/mg prot)＝[(ΔA +0.001)÷0.0008×V1]÷(V1×Cpr )÷T=41.6×(ΔA +0.001)÷Cpr

(2)按鲜重计算：

单位的定义：37℃每 g组织每分钟产生 1μg还原糖定义为一个酶活性单位。

B-AI活性(μg/min/g鲜重)＝[(ΔA +0.001)÷0.0008×V1]÷(W ×V1÷V2)=41.6×(ΔA +0.001)÷W

V1：加入反应体系中样本体积，0.05mL；V2：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，30min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g。