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酸性蛋白酶测试盒(可见分光光度法)
酸性蛋白酶测试盒(可见分光光度法)图片
货号: ACPT-2-W
包装: 50管/24样
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货号: ACPT-2-W
半岛bd体育手机客户端 介绍

注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

ACP是一种在酸性环境下催化蛋白质水解的酶。该酶主要用于酒精发酵、啤酒酿造、毛皮软化、果酒澄清、酱油酿造、饲料等。

测定原理:

酸性条件下,ACP催化酪蛋白水解产生酪氨酸;在碱性条件下,酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝;钨蓝在 680nm有特征吸收峰,通过测定其吸光度增加,来计算 ACP活性。

自备半岛游戏平台官网入口网址 和样品:

可见分光光度计、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿、1.5 mL EP管和蒸馏水。

试剂组成和配置:

液体一:1.5mL×1支,4℃保存。

液体二:1mL×1支,4℃保存。

试剂一的配制:临用前按液体一:液体二:蒸馏水=76(μL):17(μL):18(mL)的比例配制,现配现用,如出现白色絮状沉淀则不能用。

试剂二:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加 10 mL蒸馏水溶解。

试剂三:粉剂×1瓶,4℃避光保存。临用前加入 20 mL试剂一,沸水浴中磁力搅拌溶解。(可在烧杯上盖一层保鲜膜,注意观察,避免水分全部蒸发,一般加热 15-30分钟,该试剂为过饱和试剂,充分混匀后仍出现颗粒物不溶物不影响使用)。

试剂四:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加入 50 mL蒸馏水溶解。试剂五:液体 10mL×1瓶,4℃保存。

标准品:液体 1mL×1支,0.25 μ mol/mL标准酪氨酸溶液,4℃保存。

粗酶液提取:

1.试剂一的配制:见试剂的组成和配制。

2.组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10的比例(建议称取约 0.1g组织,加入 1mL试剂一)冰浴匀浆,8000g,4℃离心 10min,取上清,即粗酶液。

3.血清或培养液:直接测定。

4.细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1的比例(建议 500万细胞加入 1mL试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3秒,间隔7秒,总时间 3min);然后 8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。

测定操作:

1.分光光度计预热 30min,调节波长到 680 nm,蒸馏水调零。

2.试剂二、试剂三和试剂四置于 30℃水浴保温 30min。

3.对照管:取一支 EP管,加入 100μL粗酶液,200μL试剂二,混匀后置于 30℃水浴保温10min;加入 200μL试剂三,混匀后 8000g, 4℃离心 10min;取 200μL上清液,加入新的 EP管,再加入 1000μL试剂四,200μL试剂五,混匀后置于 30℃水浴保温 20min,于 680nm测定光吸收,记为 A对照管。

4.测定管:取一支 EP管,加入 100μL粗酶液,200μL试剂三,混匀后置于 30℃水浴保温10min;加入 200μL试剂二,混匀后 8000g, 4℃离心 10min;取 200μL上清液,加入新的EP管,再加入 1000μL试剂四,200μL试剂五,混匀后置于 30℃水浴保温 20min,于 680nm测定光吸收,记为 A测定管。(注意与空白管不同,先加试剂三,后加试剂二)

5.空白管:取 EP管,加入 200μL蒸馏水,1000μL试剂四,200μL试剂五,混匀后置于 30℃水浴保温 20min,于 680nm测定光吸收,记为 A空白管。6.标准管:取 EP管,加入 200μL标准品,1000μL试剂四,200μL试剂五,混匀后置于 30℃水浴保温 20min,于 680nm测定光吸收,记为 A标准管。注意:空白管和标准管只需要测定一次。

ACP活性计算公式:

1.按照样本蛋白浓度计算

ACP活性单位定义:30℃每毫克蛋白每分钟水解产生 1nmol酪氨酸为 1个酶活单位。

ACP活性(nmol/min/mg prot)= C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V反总÷(Cpr×V1)÷T= 125×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷Cpr

2.按照样本质量计算

ACP活性单位定义:30℃每克样品每分钟催化水解产生 1 nmol酪氨酸为 1个酶活单位。

ACP活性(nmol/min/g鲜重)=C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V反总÷(W×V1÷V2)÷T= 125×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷W

3.按照液体体积计算

ACP活性单位定义:30℃每毫升样品每分钟催化水解产生 1nmol酪氨酸为 1个酶活单位。

ACP活性(nmol/min/mL)=C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V反总÷V1÷T= 125×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)

1.按照细胞数量计算

ACP活性单位定义:30℃每 104个细胞每分钟催化水解产生 1nmol酪氨酸为 1个酶活单位。

ACP活性(nmol/min /104 cell)=C标准品×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)×V反总÷(细胞数量×V1÷V2)÷T= 125×(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白管)÷细胞数量

C标准品:0.25 μ mol/mL标准酪氨酸溶液;V反总:酶促反应总体积,0.5mL;Cpr:粗酶液蛋白质浓度(mg/mL);V1:加入反应体系中粗酶液体积(mL),0.1 mL;V2:提取液总体积(mL),1mL;T:催化反应时间(min),10min;W:样品质量(g)。

注意事项:

临用前配制的试剂配制好后 4℃保存,并且 3天内使用完毕。

注意事项:

1.试剂一按操作指示配制,用多少配多少,出现白色絮状沉淀则不能用。

2.临用前配制的试剂配置好后 3天内使用完毕。

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