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顺乌头酸酶(ACO)活性检测试剂盒(微量法)
顺乌头酸酶(ACO)活性检测试剂盒(微量法)图片
货号: ACO-1-Z
包装: 100管/96样
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货号: ACO-1-Z
半岛bd体育手机客户端 介绍

正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

顺乌头酸酶(aconitase),三羧酸循环中的酶,催化柠檬酸转变为异柠檬酸。柠檬酸本身不易氧化,在顺乌头酸酶作用下,通过脱水与加水反应,使羟基由β碳原子转移到α碳原子上,生成易于脱氢氧化的异柠檬酸,为进一步的氧化脱羧反应作准备。

测定原理

ACO催化柠檬酸转化成异柠檬酸,异柠檬酸氧化脱羧将 NAD+还原生成 NADH,导致 340nm处光吸收上升。

需自备的半岛游戏平台官网入口网址 和用品

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制

试剂一:100mL×1瓶,-20℃保存;

试剂二:20mL×1瓶,-20℃保存;

试剂三:1.5mL×1支,-20℃保存;

试剂四:液体 20mL×1瓶,4℃保存;

试剂五:液体 5mL×1瓶,4℃保存;

试剂六:粉剂×1支,-20℃保存;临用前加1.5mL蒸馏水充分溶解;现配现用

试剂七:粉剂×1支,4°保存;临用前加12mL试剂四充分溶解;

工作液:临用前在12mL试剂七中加入1mL蒸馏水、1mL试剂四、1mL试剂五、1mL试剂六充分混匀

样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

1、称取约 0.1g组织或收集 500万细胞,加入 1mL试剂一和 10uL试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、将匀浆转入离心管内 600g,4℃离心 5min。

3、弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心 10min。

4、上清液即胞浆提取物,可用于测定胞质顺乌头酸酶活性。

5、在步骤④的沉淀中加入 200uL试剂二和 2uL试剂三,超声波破碎(冰浴,功率 20%或200W,超声 3秒,间隔 10秒,重复 30次),用于线粒体顺乌头酸酶活性测定。

测定步骤

1、分光光度计或酶标仪预热 30min以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。

2、样本测定

(1)将工作液,置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 10min;现配现用;若分次用将工作液分装后于-20°保存,一星期内可用。

(3)在微量石英比色皿或 96孔板中加入 40μL样本 160μL工作液,混匀,立即记录 340nm处 20s时的吸光值 A1和 3min20s后的吸光值 A2,计算ΔA=A2-A1。

ACO活性计算

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每 mg组织蛋白每分钟生成 1 nmol的 NADH定义为一个酶活性单位。

ACO活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样)÷T=268×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位的定义:每 g组织每分钟生成 1 nmol的 NADH定义为一个酶活性单位。

ACO(nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=54×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每 1万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol的 NADH定义为一个酶活性单位。

ACO活性(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.108×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/ mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.04 mL;V样总:加入提取液体积,0.202 mL;T:反应时间,3min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

b.用 96孔板测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每 mg组织蛋白每分钟生成 1 nmol的 NADH定义为一个酶活性单位。

ACO活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=536×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位的定义:每 g组织每分钟生成 1 nmol的 NADH定义为一个酶活性单位。

ACO(nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总)÷T=108×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每 1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成 1 nmol的 NADH定义为一个酶活性单位。

ACO活性(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.216×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/ mol/cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.04 mL;V样总:加入提取液体积,0.202 mL; T:反应时间,3min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

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