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肉桂酸-4-羟化酶(C4H)测试盒(紫外分光光度法)
肉桂酸-4-羟化酶(C4H)测试盒(紫外分光光度法)图片
货号: C4H-2-Y
包装: 50管/48样
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货号: C4H-2-Y
半岛bd体育手机客户端 介绍

正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

C4H又称反式肉桂酸-4-单氧化酶,多存在于高等植物、酵母、菌类中,该酶催化肉桂酸羟化作用产生 4-香豆酸盐,是苯丙烷途径中继 L-苯丙氨酸解氨酶之后的**个关键酶。

测定原理:

C4H催化肉桂酸和 NADP生成 4-香豆酸盐和 NADPH,在 340nm下测定 NADPH生成速率,即可反映 C4H活性。

需自备的半岛游戏平台官网入口网址 和用品:

紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

提取液:100mL×1瓶,4℃保存;

试剂一:液体 60 mL×1瓶, 4℃保存;

试剂二:粉剂×2瓶,-20℃保存;

粗酶液提取:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1的比例(建议 500万细菌或细胞加入 1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10的比例(建议称取约 0.1g组织,加入 1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤:

1、分光光度计或酶标仪预热 30min以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。

2、样本测定

(1)取试剂二一瓶,加入 25mL试剂一充分溶解混匀,置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 5min;现配现用(配好后 24h内用完);

(2)在 1mL石英比色皿中加入 50μL样本和 950μL试剂二,混匀,立即记录 340nm处初始吸光值 A1和 5min后的吸光值 A2,计算 ΔA=A2-A1。

C4H活性计算:

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg组织蛋白每分钟产生 1 nmol的 NADPH定义为一个酶活力单位。

C4H(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=643×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g组织每分钟产生 1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

C4H(nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=643×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每 1万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

C4H(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=1.286×ΔA

V反总:反应体系总体积,1×10-3L;ε:NADPH摩尔消光系数,6.22×103L/ mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.05 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

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