正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

LAP是一类能水解肽链 N-末端为亮氨酸的酶，广泛存在于肝、肾、胰等组织中，尤其以肝脏中含量最为丰富。各类肝病患者因肝细胞损伤，血清 LAP的活性均有不同程度的升高，因此，血清 LAP活性的检测能从不同侧面反映各种肝病的发生和发展。

测定原理：

LAP分解 L-亮氨酰对硝基苯胺生成对硝基苯胺，后者在 405nm有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算 LAP活性。

自备用品：

酶标仪/可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、96孔板/微量石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：液体 100mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体 15mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1瓶，-20℃保存；

样本的前处理：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量(10⁴个)：提取液体积(mL)为 1000～5000：1的比例(建议 2000万细菌或细胞加入 1mL提取液)，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率 20%或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30次)；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5～10的比例(建议称取约 0.1g组织，加入 1mL提取液)，进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、血清(浆)样品：直接检测。

LAP测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min以上，调节波长至 405nm，蒸馏水调零。

2、将试剂二转移至试剂一中充分溶解(如较难溶解，可 50℃水浴加热约 30min促进溶解)；在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 10min以上；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

3、在微量石英比色皿或 96孔板中加入 50μL样本和 150μL试剂一，混匀后立即记录 405nm处初始吸光值 A1和 2min后的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。

注意事项：若 ΔA大于 0.5，需将酶液用提取液稀释，计算公式中乘以相应稀释倍数。使A2-A1小于 0.5，可提高检测灵敏度。

LAP活力单位的计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血清(浆)LAP活力的计算:

单位的定义：每 mL血清(浆)每分钟生成 1 nmol的对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP(nmol/min/mL)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷V样÷T=205.8×ΔA

2、组织、细菌或细胞中 LAP活力的计算:

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg组织蛋白每分钟生成 1 nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T=205.8×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g组织每分钟生成 1 nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP(nmol/min/g鲜重)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W× V样÷V样总)÷T=205.8×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP(nmol/min/10⁴cell)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(2000×V样÷V样总)÷T=0.103×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：对硝基苯胺摩尔消光系数，9.72×10³L/ mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；2000：细菌或细胞总数，2000万。

b.用 96孔板测定的计算公式如下

1、血清(浆)LAP活力的计算:

单位的定义：每 mL血清(浆)每分钟生成 1 nmol的对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP(nmol/min/mL)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷V样÷T=411.5×ΔA

2、组织、细菌或细胞中 LAP活力的计算:

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg组织蛋白每分钟生成 1 nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷ (V样×Cpr)÷T=411.5×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g组织每分钟生成 1 nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP(nmol/min/g鲜重)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W× V样÷V样总)÷T=411.5×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP(nmol/min/10⁴cell)＝[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(2000×V样÷V样总)÷T=0.206×ΔA

V反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：对硝基苯胺摩尔消光系数，9.72×10³L/ mol/cm；d：

96孔板光径，0.5cm；V样：加入样本体积，0.05 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；2000：细菌或细胞总数，2000万。