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抗坏血酸过氧化物酶(APX)测试盒(微量法)
抗坏血酸过氧化物酶(APX)测试盒(微量法)图片
货号: APX-1-W
包装: 100管/96样
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货号: APX-1-W
半岛bd体育手机客户端 介绍

注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

APX是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一,也是抗坏血酸代谢的关键酶之一。APX具有多种同功酶,分别定位于叶绿体、胞质、线粒体、过氧化物和乙醛酸体,以及过氧化体和类囊体膜上。APX催化 H2O2氧化 AsA,是植 AsA的主要消耗者。APX的活性直接影响到AsA的含量,APX与 AsA具有一定的负相关性。

测定原理:

APX催化 H2O2氧化 AsA,通过测定 AsA氧化速率,来计算得 APX活性。

自备半岛游戏平台官网入口网址 用品:

低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板(UV板)、移液枪、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制:

试剂一:液体 120mL×1瓶,4℃保存。

试剂二:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加 3 mL蒸馏水充分溶解。

试剂三:液体 3mL×1支,4℃保存。

粗酶液提取:

按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10的比例(建议称取约 0.1g组织,加入 1mL试剂一)进行冰浴匀浆。13000g,4℃离心 20min,取上清置冰上待测。

测定:

1.分光光度计/酶标仪预热 30 min以上,调节波长到 290nm,用蒸馏水调零。

2.试剂一在 25℃中预热 30min。

3.依次在微量石英比色皿/96孔板中加入 20μL上清液、140μL预热的试剂一 20μL试剂二和20μL试剂三,迅速混匀后在 290nm测定 10s和 130s光吸收 A1和 A2,△A=A1-A2。

APX活性计算:

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算

活性单位定义:每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol AsA为 1个酶活单位。

APX(nmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d)×V反总×109÷(Cpr×V样)÷T=1786×△A÷ Cpr

(2)按样本质量计算

活性单位定义:每 g组织每分钟氧化 1nmol AsA为 1个酶活单位。

APX(nmol/min/g鲜重 ) = △A÷(ε×d)×V反总×109÷(W×V样÷V样总)÷T=1786×△A÷W

ε:AsA在 290nm处摩尔吸光系数为 2.8×103L/mol/cm;d:比色皿光径(cm),1 cm;V反总:反应体系总体积(L),200μL=2×10-4L;109:1mol=1×109nmol;Cpr:上清液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测定,建议使用本公司 BCA蛋白质含量测定试剂盒;W :样品质量;V样:加入反应体系中上清液体积(mL),20μL=0.02mL;V样总:提取液体积,1 mL; T:催化反应时间(min),2min。

b.使用 96孔板测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算

活性单位定义:每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol AsA为 1个酶活单位。

APX(nmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d)×V反总×109÷(Cpr×V样)÷T=3571×△A÷ Cpr

(2)按样本质量计算

活性单位定义:每 g组织每分钟氧化 1nmol AsA为 1个酶活单位。

APX(nmol/min/g鲜重) = △A÷(ε×d)×V反总×109÷(W×V样÷V样总)÷T=3571×△A÷W

ε:AsA在 290nm处摩尔吸光系数为 2.8×103L/mol/cm;d:96孔板光径(cm),0.5 cm;V反总:反应体系总体积(L),200μL=2×10-4L;109:1mol=1×109nmol;Cpr:上清液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测定,建议使用本公司 BCA蛋白质含量测定试剂盒;W :样品质量;V样:加入反应体系中上清液体积(mL),20μL=0.02mL;V样总:提取液体积,1 mL; T:催化反应时间(min),2min。

注意事项:

配制好的试剂二 4℃保存,并且 3天内使用完。

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