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注意：正式实验之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： 蛋白质羰基是多种氨基酸在蛋白质的氧化修饰过程中的早期标志，其含量高低表明蛋白质氧化损伤程度的大小，是衡量蛋白质氧化损伤的主要指标。 测定原理： 羰基与 2,4-二硝基苯肼反应生成红色 2,4-二硝基苯腙，在 370nm 处有特征吸收峰。 自备实验用品及半岛游戏平台官网入口网址 ： 天平、恒温水浴锅、低温离心机、漩涡震荡仪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、蒸馏水、无水乙醇、乙酸乙酯。 试剂组成和配制： 提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。 试剂一：粉剂 0.1g×6 支，4℃避光保存。(使用前根据样品数，每支加 1mL 水溶解，每支为10 个样品用量) 试剂二：液体 8mL×1 瓶，4℃避光保存。 试剂三：液体 8mL×1 瓶，4℃保存。 试剂四：液体 18mL×1 瓶，4℃保存。 试剂五：根据测定样品量，将乙酸乙酯和无水乙醇等体积混合。 试剂六：液体 35mL×1 瓶，4℃保存。 样品处理： 1. 组织样品：按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5～10 的比例(建议称取约 0.1g组织，加入 1mL 提取液)进行冰浴匀浆，于 4℃，4000g 离心 10min，取上清，加入 0.1mL试剂一，室温放置 10min，4℃，10000g 离心 10min，取上清待测。 2.细菌、真菌：按照细胞数量(104 个)：提取液体积(mL)为 500～1000：1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 提取液)，冰浴超声波破碎细胞(功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min)；然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。 3.血清等液体样本：直接测定。 测定步骤和操作表： 1、 分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长至 370nm。 2、操作表
计算公式： a．用微量石英比色皿测定的计算公式如下 1.按照样本蛋白浓度计算 蛋白质羰基含量(μmol/mg prot)= [ΔA370×V 反总÷(ε×d)]÷(V 样×Cpr) =0.227×ΔA370÷Cpr 2.按照样本重量计算 蛋白质羰基含量(μmol/g 鲜重)= [ΔA370×V 反总÷(ε×d)]÷(W ×V 样÷V 样总) =0.227×ΔA370÷W 3. 按照细胞数量计算 蛋白质羰基含量(μmol/104cell)= [ΔA370×V 反总÷(ε×d)]÷(细胞数量 ×V 样÷V 样总)=0.227×ΔA370÷细胞数量 4.按照液体体积计算 蛋白质羰基含量(μmol/mL)= [ΔA370×V 反总÷(ε×d)]÷V 样=0.227×ΔA370 V 反总：反应体系总体积，0.3 mL；ε：羰基毫摩尔消光系数，22 L/mmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.06 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，W：样本质量，g b．用 96 孔板测定的计算公式如下 1.按照样本蛋白浓度计算 蛋白质羰基含量(μmol/mg prot)= [ΔA370×V 反总÷(ε×d)]÷(V 样×Cpr) =0.454×ΔA370÷Cpr 2.按照样本重量计算 蛋白质羰基含量(μmol/g 鲜重)= [ΔA370×V 反总÷(ε×d)]÷(W ×V 样÷V 样总) =0.454×ΔA370÷W 3.按照细胞数量计算 蛋白质羰基含量(μmol/104cell)= [ΔA370×V 反总÷(ε×d)]÷(细胞数量 ×V 样÷V 样总)=0.454×ΔA370÷细胞数量 4. 按照液体体积计算 蛋白质羰基含量(μmol/mL)= [ΔA370×V 反总÷(ε×d)]÷V 样=0.454×ΔA370 V 反总：反应体系总体积，0.3 mL；ε：羰基毫摩尔消光系数，22 L/mmol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.06 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，W：样本质量，g 注意事项： 1.试剂一使用前根据要测定的样品数现配，配置好后 4℃保存，若变为黑色，则不能使用。 2.试剂二见光易分解，反应需严格避光。 |
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