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蛋白质羰基测试盒(微量法)
蛋白质羰基测试盒(微量法)图片
货号: DTJ-1-G
包装: 100管/48样
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半岛bd体育手机客户端 介绍

注意:正式实验之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

蛋白质羰基是多种氨基酸在蛋白质的氧化修饰过程中的早期标志,其含量高低表明蛋白质氧化损伤程度的大小,是衡量蛋白质氧化损伤的主要指标。

测定原理:

羰基与 2,4-二硝基苯肼反应生成红色 2,4-二硝基苯腙,在 370nm 处有特征吸收峰。

自备实验用品及半岛游戏平台官网入口网址 :

天平、恒温水浴锅、低温离心机、漩涡震荡仪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、蒸馏水、无水乙醇、乙酸乙酯。

试剂组成和配制:

提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。

试剂一:粉剂 0.1g×6 支,4℃避光保存。(使用前根据样品数,每支加 1mL 水溶解,每支为10 个样品用量)

试剂二:液体 8mL×1 瓶,4℃避光保存。

试剂三:液体 8mL×1 瓶,4℃保存。

试剂四:液体 18mL×1 瓶,4℃保存。

试剂五:根据测定样品量,将乙酸乙酯和无水乙醇等体积混合。

试剂六:液体 35mL×1 瓶,4℃保存。

样品处理:

1. 组织样品:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g组织,加入 1mL 提取液)进行冰浴匀浆,于 4℃,4000g 离心 10min,取上清,加入 0.1mL试剂一,室温放置 10min,4℃,10000g 离心 10min,取上清待测。

2.细菌、真菌:按照细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 10000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。

3.血清等液体样本:直接测定。

测定步骤和操作表:

1、 分光光度计/酶标仪预热 30min,调节波长至 370nm。

2、操作表


对照管 测定管
样品(μL) 60 60
试剂二(μL)
120
试剂三(μL) 120
混匀,37℃避光反应 1h
试剂四(μL) 150 150
静置 5min,4℃,12000g 离心 15min,弃上清,留沉淀
试剂五(μL) 300 300
漩涡混匀,4℃,12000g 离心 10min,弃上清,留沉淀
试剂五(μL) 300 300
漩涡混匀,4℃,12000g 离心 10min,弃上清,留沉淀
试剂五(μL)
300
300
漩涡混匀,4℃,12000g 离心 10min,弃上清,留沉淀
试剂六(μL)
300 300

漩涡混匀,37℃温育 15min,沉淀全部溶解后,4℃,12000g 离心 15min,取上清 200μL 于微量石英比色皿/96 孔板中,测定 A370。ΔA=A 测定管-A 对照管

计算公式:

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1.按照样本蛋白浓度计算

蛋白质羰基含量(μmol/mg prot)= [ΔA370×V 反总÷(ε×d)]÷(V 样×Cpr) =0.227×ΔA370÷Cpr

2.按照样本重量计算

蛋白质羰基含量(μmol/g 鲜重)= [ΔA370×V 反总÷(ε×d)]÷(W ×V 样÷V 样总) =0.227×ΔA370÷W

3. 按照细胞数量计算

蛋白质羰基含量(μmol/104cell)= [ΔA370×V 反总÷(ε×d)]÷(细胞数量 ×V 样÷V 样总)=0.227×ΔA370÷细胞数量

4.按照液体体积计算

蛋白质羰基含量(μmol/mL)= [ΔA370×V 反总÷(ε×d)]÷V 样=0.227×ΔA370

V 反总:反应体系总体积,0.3 mL;ε:羰基毫摩尔消光系数,22 L/mmol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.06 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL,W:样本质量,g

b.用 96 孔板测定的计算公式如下

1.按照样本蛋白浓度计算

蛋白质羰基含量(μmol/mg prot)= [ΔA370×V 反总÷(ε×d)]÷(V 样×Cpr) =0.454×ΔA370÷Cpr

2.按照样本重量计算

蛋白质羰基含量(μmol/g 鲜重)= [ΔA370×V 反总÷(ε×d)]÷(W ×V 样÷V 样总) =0.454×ΔA370÷W

3.按照细胞数量计算

蛋白质羰基含量(μmol/104cell)= [ΔA370×V 反总÷(ε×d)]÷(细胞数量 ×V 样÷V 样总)=0.454×ΔA370÷细胞数量

4. 按照液体体积计算

蛋白质羰基含量(μmol/mL)= [ΔA370×V 反总÷(ε×d)]÷V 样=0.454×ΔA370

V 反总:反应体系总体积,0.3 mL;ε:羰基毫摩尔消光系数,22 L/mmol/cm;d:96 孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.06 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL,W:样本质量,g

注意事项:

1.试剂一使用前根据要测定的样品数现配,配置好后 4℃保存,若变为黑色,则不能使用。

2.试剂二见光易分解,反应需严格避光。

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