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吡咯啉-5-羧酸还原酶(P5CR)测试盒(紫外分光光度法)
吡咯啉-5-羧酸还原酶(P5CR)测试盒(紫外分光光度法)图片
货号: P5CR-2-W
包装: 50管/24样
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货号: P5CR-2-W
半岛bd体育手机客户端 介绍

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

吡咯啉-5-羧酸还原酶( P5CRs) 是普遍存在于原核和真核生物中的一类重要的管家蛋白。其主要功能是催化脯氨酸生物合成的最后一步反应,将吡咯啉-5-羧酸( P5C) 转化为脯氨酸, 在调节细胞凋亡等一系列病理和生理过程中起着重要作用。

测定原理:

P5CR 具有噻唑烷-4-羧酸脱氢酶活性,催化噻唑烷-4-羧酸的脱氢反应,同时将 NAD 转化为NADH,使 WST-8 变成橙黄色,测定 450nm 下吸光值增加速率来反映酶的活性。

需自备的半岛游戏平台官网入口网址 和用品:

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制:

提取液:液体 60mL×1 瓶,4℃保存;

试剂一:液体 60mL×1 瓶,4℃保存;

试剂二:粉剂×1 瓶,4℃保存;

试剂三:粉剂×1 瓶,-20℃保存;

试剂四:液体 3mL×1 瓶,4℃避光保存。

粗酶液提取:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);12000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织, 加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。12000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤:

1、 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 450nm。

2、 样本测定

(1)临用前在试剂二中加入 30mL 试剂一,试剂三中加入 15mL 试剂一,充分溶解混匀, 用不完的试剂分装后-20℃保存;

(2)工作液的配制:临用前按照样本数量,按以下比例配制工作液

试剂名称(μL) 测定工作液 对照工作液
试剂一
450
试剂二 450 450
试剂三 450
试剂四 50 50

(3)按下表在 96 孔板中加入如下试剂

试剂名称(μL) 测定管 对照管
样本 50 50
测定工作液 950
对照工作液
950

37℃避光孵育 30min,450nm 下测定吸光值 A 测定与 A 对照,△A=A 测定-A 对照。每个测定管需设一个对照管。

P5CR 活性计算:

标准条件下测定回归方程为 y = 1.3384x - 0.0285,R2 = 0.999; x 为 NADH 含量(μmol/mL),y 为吸光值。

1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

P5CR(nmol/min/mg prot)= (△A+0.0285)÷ 1.3384×V 样÷(V 样×Cpr)×1000÷T= 24.9×(△A+0.0285)÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g 组织每分钟产生 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

P5CR(nmol/min/g 鲜重)= (△A+0.0285)÷ 1.3384×V 样÷(W ×V 样÷V 样总)×1000÷T= 24.9×(△A+0.0285)÷Cpr

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

P5CR(nmol/min/104cell)= (△A+0.0285)÷ 1.3384×V 样÷(500×V 样÷V 样总)×1000÷T=0.0498×(△A+0.0285)

V 样:加入样本体积,0.05 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,30 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万;1000,μmol 到 nmol 的换算系数。

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