半岛bd体育手机客户端 介绍
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定 测定意义: α-L-Af 是一种能够水解非还原呋喃阿拉伯糖残基的糖苷酶类,使细胞壁阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯甘露聚糖等中性糖不断解离,促进果胶的增溶和降解。由于果实成熟过程中常常伴随着阿拉伯糖的丧失,该酶活性在果实成熟软化中的研究具有重大意义。 测定原理: α-L-Af 分解对硝基酚阿拉伯呋喃糖苷生成对-硝基苯酚,后者在 400nm 有最大吸收峰,通过测定吸光值升高速率来计算 α-L-Af 活性。 自备用品: 酶标仪/可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、96 孔板/微量石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂组成和配制: 提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。 试剂一:粉剂×1 瓶,-20℃保存;临用前加入 2.5mL 蒸馏水,充分溶解备用;用不完的试剂仍-20℃保存。 试剂二:液体 4mL×1 瓶,4℃保存。 试剂三:液体 13mL×1 瓶,4℃保存。 粗酶液提取: 1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);15000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织, 加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 测定步骤: 1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 400nm,蒸馏水调零。 2、样本测定(在 EP 管或 96 孔板中依次加入下列试剂):
充分混匀, 400nm 处测定吸光值 A,计算 ΔA=A 测定-A 对照。每个测定管需设一个对照管。 α-L-Af 活性计算: a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下 标准条件下测定的回归方程为 y =0.00585x -0.0027;x 为标准品浓度(nmol/mL),y 为吸光值。 (1)按样本蛋白浓度计算: 单位的定义:每 mg 组织蛋白每 min 产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。 α-L-Af 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V 反总]÷(V 样×Cpr)÷T=39.89×(ΔA+0.0027) ÷Cpr (2)按样本鲜重计算: 单位的定义:每 g 组织每小时产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。 α-L-Af 活性(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V 反总]÷(W×V 样÷V 样总)÷T=39.89×(ΔA+0.0027) ÷W (3)按细菌或细胞密度计算: 单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每小时产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。 α-L-Af 活性(nmol/min/104cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V 反总]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.08×(ΔA +0.0027) Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;V 反总:反应体系总体积,0.07mL;V 样:加入反应体系中样本体积,0.01mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;W:样本质量,g; 500:细胞或细菌总数,500 万;T:反应时间,30min。 b.用 96 孔板测定的计算公式如下标准条件下测定的回归方程为 y = 0.0039x -0.0027;x 为标准品浓度(nmol/mL),y 为吸光值。 (1)按样本蛋白浓度计算: 单位的定义:每 mg 组织蛋白每小时产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。 α-L-Af 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V 反总]÷(V 样×Cpr)÷T=59.83×(ΔA+0.0027) ÷Cpr (2)按样本鲜重计算: 单位的定义:每 g 组织每小时产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。 α-L-Af 活性(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0027)÷0.0039×V 反总]÷(W×V 样÷V 样总)÷T=59.83×(ΔA+0.0027) ÷W (3)按细菌或细胞密度计算: 单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每小时产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。 α-L-Af 活性(nmol/min/104cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V 反总]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.12×(ΔA +0.0027) Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;V 反总:反应体系总体积,0.07mL;V 样:加入反应体系中样本体积,0.01mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;W:样本质量,g; 500:细胞或细菌总数,500 万;T:反应时间,30min。 |
相关半岛bd体育手机客户端
|