正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

α-L-Af 是一种能够水解非还原呋喃阿拉伯糖残基的糖苷酶类，使细胞壁阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯甘露聚糖等中性糖不断解离，促进果胶的增溶和降解。由于果实成熟过程中常常伴随着阿拉伯糖的丧失，该酶活性在果实成熟软化中的研究具有重大意义。

测定原理：

α-L-Af 分解对硝基酚阿拉伯呋喃糖苷生成对-硝基苯酚，后者在 400nm 有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算 α-L-Af 活性。

自备用品：

酶标仪/可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、96 孔板/微量石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 2.5mL 蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存。

试剂二：液体 4mL×1 瓶，4℃保存。

试剂三：液体 13mL×1 瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量(10⁴个)：提取液体积(mL)为 500～1000：1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液)，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率 20%或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次)；15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5～10 的比例(建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 提取液)，进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 400nm，蒸馏水调零。

2、样本测定(在 EP 管或 96 孔板中依次加入下列试剂)：

试剂名称(μL)	测定管	对照管
试剂一	25
蒸馏水		25
试剂二	35	35
样本	10	10
迅速混匀，放入 37℃保温 30min
试剂三	130	130

充分混匀， 400nm 处测定吸光值 A，计算 ΔA=A 测定-A 对照。每个测定管需设一个对照管。

α-L-Af 活性计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准条件下测定的回归方程为 y =0.00585x -0.0027；x 为标准品浓度(nmol/mL)，y 为吸光值。

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每 min 产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

α-L-Af 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V 反总]÷(V 样×Cpr)÷T=39.89×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每小时产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

α-L-Af 活性(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V 反总]÷(W×V 样÷V 样总)÷T=39.89×(ΔA+0.0027) ÷W

(3)按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每小时产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

α-L-Af 活性(nmol/min/10⁴cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V 反总]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.08×(ΔA +0.0027)

Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；V 反总：反应体系总体积，0.07mL；V 样：加入反应体系中样本体积，0.01mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；W：样本质量，g； 500：细胞或细菌总数，500 万；T：反应时间，30min。

b.用 96 孔板测定的计算公式如下

标准条件下测定的回归方程为 y = 0.0039x -0.0027；x 为标准品浓度(nmol/mL)，y 为吸光值。

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每小时产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

α-L-Af 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V 反总]÷(V 样×Cpr)÷T=59.83×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每小时产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

α-L-Af 活性(nmol/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0027)÷0.0039×V 反总]÷(W×V 样÷V 样总)÷T=59.83×(ΔA+0.0027) ÷W

(3)按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每小时产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活性单位。

α-L-Af 活性(nmol/min/10⁴cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.0039×V 反总]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.12×(ΔA +0.0027)

Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；V 反总：反应体系总体积，0.07mL；V 样：加入反应体系中样本体积，0.01mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；W：样本质量，g； 500：细胞或细菌总数，500 万；T：反应时间，30min。