正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义９�/span>

GOGAT 广泛分布于植物中，和谷氨酰胺合成酶共同构� GS/GOGAT 循环，参与氨同化的调控。GOGAT 分为� NADH 为还原剂� NADH-GOGAT 和以铁氧还蛋白为还原剂的Fd-GOGAT。Fd-GOGAT 主要存在于叶绿体基质中，与光合作用和光呼吸有关，主要同化NO₃^-还原和光呼吸产生� NH₄⁺、�/span>

测定原理９�/span>

Fd-GOGAT 催化谷氨酰胺的氨基转移到 α-酮戊二酸，形成两分子的谷氨酸，谷氨酸脱氢酶催化谷氨酸的脱氢反应，同时产生 NADH，使 WST-8 显橙黄色，在 450 nm 下测定吸光值、�/span>

需自备的仪器和用品９�/span>

酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器�?6 孔板、研钵、冰和蒸馏水、�/span>

试剂组成和配制：

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：粉剂�? 瓶，4℃保存；临用前加� 12mL 试剂六溶解待用，用不完的试剂 4℃保存；

试剂二：液体 6mL×1瓶，4℃避光保存；

试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加� 5mL 蒸馏水溶解待用，用不完的试剂 4℃保存；

试剂四：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前加� 20mL 试剂六溶解待用，用不完的试剂分装�?20℃保存；

试剂五：液体 3mL×1 瓶，4℃避光保存； 试剂六：液体 40mL×1 瓶，4℃保存；

粗酶液提取：

按照组织质量(g)：提取液体积(mL)� 1�?�?0 的比�?建议称取� 0.1g 组织，加� 1mL提取�?，进行冰浴匀浆�?0000g 4℃离� 10min，取上清，置冰上待测、�/span>

测定步骤９�/span>

1� 酶标仪预� 30min 以上，调节波长至 450nm、�/span>

2� 样本测定

� EP 管中加入如下试剂

试剂名称(μL)	测定箠�/span>	对照箠�/span>
试剂一	100	100
试剂事�/span>	50	50
充分混匀�?0℃保� 5min
样本	50	50
试剂丈�/span>	50
氳�/span>		50
充分混匀�?0℃准确反� 30min�?5℃水� 5min 终止反应，冷却后 10000g 4℃离� 5min，取上清液待浊�/span>

3� 工作液配刵�/span>

临用前按试剂四：试剂亓�180:20(μL)的比例配制工作液，用多少配多少、�/span>

4� 谷氨酸含量测宙�/span>

� 96 孔板中加入如下试剁�/span>

试剂名称(μL)	测定箠�/span>	对照箠�/span>
上清涱�/span>	20	20
工作涱�/span>	180	180

混匀�?5℃反� 30min�?50nm 下测定吸光� A 测定与对照，△A=A 测定-A 对照，每个测定管设一个对照管、�/span>

Fd-GOGAT 活性计算：

标准曲线� y = 2.2168x - 0.0005，R2 = 0.9996；其� x 为标准品浓度 μmol/mL, y 为吸光值△A、�/span>

1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：� mg 组织蛋白每分钟产� 1 nmol 的谷氨酸定义为一个酶活力单位、�/span>

Fd-GOGAT(nmol/min/mg prot)=(ΔA+0.0005)÷ 2.2168×V 反总�?V 样×Cpr) ÷T×1000=75.2×(ΔA+0.0005)÷Cpr

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：� g 组织每分钟产� 1 nmol 的谷氨酸定义为一个酶活力单位、�/span>

Fd-GOGAT(nmol/min/g 鲜重)=(ΔA+0.0005)÷ 2.2168×V 反总�?W× V 样÷V 样�? ÷T×1000=75.2×(ΔA+0.0005)÷W

V 反总：反应体系总体积，0.25mL；ε：V 样：加入样本体积�?.05 mL；V 样总：加入提取 液体积，1 mL；T：反应时间，30 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g�?000，μmol � nmol 的换算系数、�/span>