正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义９�/strong>

ACL(EC4.1.3.8)是脂肪酸合成中的关键酶，其催化产生的乙酰辅酶 A 可用于脂肪酸合成和碳链延长、黄酮类物质合成、氨基酸合成等、�/p>

测定原理９�/strong>

ACL � ATP 和辅� A 存在的情况下催化柠檬酸裂解为乙酰辅酶 A、草酰乙酸、腺苷二磷酸和磷酸盐。苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和 NADH 生成苹果酸和 NAD+，在 340nm � � NADH 减少速率，计� ACL 活性、�/p>

需自备的仪器和用品９�/strong>

紫外分光光度�?酶标仪、台式离心机、水浴锅、移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水

试剂组成和配制：

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液� 20mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存；

试剂三：液体 2μL×1 支，4℃保存；

样本的前处理９�/strong>

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数�?10⁴�?：提取液体积(mL)� 500�?000�? 的比�?建议 500 万细菌或细胞加入 1mL � 取液)，超声波破碎细菌或细�?冰浴，功� 20%� 200W，超� 3s，间� 10s，重� 30 �?�?000g 4℃离� 10min，取上清，置冰上待测、�/p>

2、组织：按照组织质量(g)：提取液体积(mL)� 1�?�?0 的比�?建议称取� 0.1g 组织� 加入 1mL 提取�?，进行冰浴匀浆�?000g 4℃离� 10min，取上清，置冰上待测、�/p>

3、血�?�?样品：直接检测、�/p>

测定步骤９�/strong>

1� 分光光度计或酶标仪预� 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零、�/p>

2� 样本测定

(1)工作液的配置，将试剂二和试剂三转移至试剂一中，充分混合溶解，置� 37�?哺乳 动物)� 25�?其它物种)水浴 5min�?注意：可取少量试剂一至试剂二和试剂三中，� 分混匀溶解后转移至试剂一瓶中，重� 2-3 �?；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复 冻融、�/p>

(2)在微量石英比色皿� 96 孔板中加� 10μL 样本� 190μL 工作液，混匀，立即记� 340nm � 20s 时的吸光� A1 � 2min20s 后的吸光� A2，计� ΔA=A1-A2、�/p>ACL 活性计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如上�/strong>

1、血�?�?ACL 活力计算

单位定义：每毫升血�?�?每分钟消� 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位、�/p>

ACL(nmol/min/mL)＝[ΔA×V 反总�?ε×d)×10⁹]÷V 样÷T=1608×ΔA

2、组织、细菌或细胞� ACL 活力计算

(1)按样本蛋白浓度计箖�/p>

单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟消� 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位、�/p>

ACL(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V 反总�?ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计箖�/p>

单位定义：每 g 组织每分钟消� 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位、�/p>

ACL(nmol/min/g 鲜重)＝[ΔA×V 反总�?ε×d)×10⁹]÷(W ×V 样÷V 样�?÷T=1608×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算９�/p>

单位定义：每 1 万个细胞每分钟消� 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位、�/p>

ACL(nmol/min/10⁴cell)＝[ΔA×V 反总�?ε×d)×10⁹]÷(500×V 样÷V 样�?÷T=3.216×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：NADH 摩尔消光系数�?.22×10³L / mol /cm；d� 比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积�?.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T� 反应时间�? min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g�?00：细菌或细胞� 数，500 万、�/p>b.� 96 孔板测定的计算公式如上�/strong>

1、血�?�?ACL 活力计算

单位定义：每毫升血�?�?每分钟消� 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位、�/p>

ACL(nmol/min/mL)＝[ΔA×V 反总�?ε×d)×10⁹]÷V 样÷T=3216×ΔA

2、组织、细菌或细胞� ACL 活力计算

(1)按样本蛋白浓度计箖�/p>

单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟消� 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位、�/p>

ACL(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V 反总�?ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计箖�/p>

单位定义：每 g 组织每分钟消� 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位、�/p>

ACL(nmol/min/g 鲜重)＝[ΔA×V 反总�?ε×d)×10⁹]÷(W× V 样÷V 样�?÷T=3216×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算９�/p>

单位定义：每 1 万个细胞每分钟消� 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位、�/p>

ACL(nmol/min/10⁴cell)＝[ΔA×V 反总�?ε×d)×10⁹]÷(500×V 样÷V 样�?÷T=6.432×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：NADH 摩尔消光系数�?.22×10³L / mol /cm；d９�/p>

96 孔板光径�?.5cm；V 样：加入样本体积�?.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T� 反应时间�? min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g�?00：细菌或细胞� 数，500 万、�/p>