意义：线粒体转氢酶-2 (Mitochondrial hydrogenase-2, TH-2) 位于线粒体的内膜上，又称为线粒体复合体六，催化 NADH+ NADP+ 和 NAD++ NADPH 相互转化，调节线粒体 NAD(H) 和 NADP(H) 平衡。 把逆向反应称为 TH-2，催化 NADPH 和 NAD+ 生成 NADP+ 和 NADH。

原理：NADH 和 NADPH 均在 340nm 有特征吸收，因此 TH 催化的转氢反应不能导致 340nm 吸光度发生变化。用人工合成底物 3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸(APAD+)替代 NAD+，TH-2 催化 APAD+ 还原生成 APADH，APADH 在 375nm 有特征光吸收，测定 375nm 光吸收的增加速率，来计算 TH-2 活性。

检测方法：微量法

半岛bd体育手机客户端 组成及保存条件：

编号	规格	储存条件
AK257-A	100 mL×1 瓶	-20℃保存；
AK257-B	50 mL×1 瓶	-20℃保存；
AK257-C	18 mL×1 瓶	4℃保存。
AK257-D	粉剂×1 支	-20℃保存；
AK257-E	粉剂×1 支	-20℃保存；

※ 正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

自备用品：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

样品的制备：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离

1. 准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL AK257-A，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2. 将匀浆液 600g，4℃离心 5min。

3. 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。

4. 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的 TH-2(此步可选做)。

5. 步骤 4 中的沉淀即为线粒体，加入 500uL AK257-B，超声波破碎(冰浴，功率 20% 或 200W， 超声 3s，间隔 10 秒，重复 30 次)，用于 TH-2 活性测定。

测定步骤：

1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上，调节波长到 375 nm，蒸馏水调零。

2. 工作液的配制：临用前将 AK257-D, E 转移到 AK257-C 中混合溶解，置于 37℃(哺乳动物)或

25℃(其它物种)水浴 5min，现配现用；

3. 在 微量石英比色皿或 96 孔板中按顺序加入下列试剂

试剂名称	测定管 (μL)
样品	20
工作液	180
混匀，立即记录 375 nm 处初始吸光值 A1 和 10min 后的吸光值 A2，计算ΔA=A2-A1。

TH-2 含量计算公式：

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按样本鲜重计算

单位的定义：每g 组织每分钟产生1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。

TH-2 活性 (nmol/min/g 鲜重) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T = 74.5×ΔA÷W

(2)按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。

TH-2 活性 (nmol/min /mg prot) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr)÷T = 149×ΔA÷Cpr

※ 蛋白定量检测建议使用本公司：BCA Protein Assay Kit (C05-02001)

(3)按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1 万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。

TH-2 活性 (nmol/min /10⁴cell) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T = 0.149×ΔA

注： V 反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：APADH 摩尔消光系数，6.7×10³L / mol /cm；d：比 色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.02 mL；V 样总：加入提取液体积，0.5mL；T：反应时 间，10min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

b. 用 96 孔板测定的计算公式如下

(1)按样本鲜重计算

单位的定义：每g 组织每分钟产生1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。

TH-2 活性 (nmol/min/g 鲜重) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T = 149×ΔA÷W

(2)按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟产生1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。

TH-2 活性 (nmol/min/mg prot) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V 样×Cpr)÷T = 298×ΔA÷Cpr

※ 蛋白定量检测建议使用本公司：BCA Protein Assay Kit (C05-02001)

(3)按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1 万个细菌或细胞每分钟产生1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。

TH-2 活性 (nmol/min/10⁴cell) = [ΔA×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.298×ΔA

注： V 反总：反应体系总体积，2×10^-4L；ε：APADH 摩尔消光系数，6.7×10³L / mol /cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.02 mL；V 样总：加入提取液体积，0.5mL；T： 反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。