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介绍 意义：脂肪酸合成酶 (Fatty Acid Synthase, FAS) 是脂肪酸合成关键酶，催化乙酰辅酶 A 和丙二酰辅酶 A 而生成长链脂肪酸。FAS 普遍表达于各种组织细胞中，在哺乳动物肝、肾、脑、肺和乳腺以及脂肪组织中表达丰富。 原理：脂肪酸合成酶催化乙酰 CoA、丙二酰 CoA 和 NADPH 生成长链脂肪酸和 NADP+；NADPH 在 340nm 有吸收峰，而 NADP+没有；通过测定 340nm 光吸收下降速率，计算 FAS 活性。 检测方法：微量法 半岛bd体育手机客户端 组成及保存条件：
※ 正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。 自备用品： 研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、可调式移液枪和蒸馏水。 粗酶提取： 1. 组织：按照组织质量(g)：AK241-A 体积(mL)为 1：5～10 的比例(建议称取约 0.1g 组织，加入1mL AK241-A)进行冰浴匀浆。16000rpm，4℃离心 40min，取上清置冰上待测。 2. 细菌、真菌：按照细胞数量(104 个)：AK241-A 体积(mL)为 500～1000：1 的比例(建议 500万细胞加入 1mL AK241-A)，冰浴超声波破碎细胞(功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间3min)；然后 16000rpm，4℃，离心 40min，取上清置于冰上待测。 3. 血清等液体：直接测定。 测定步骤： 1. 分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长到 340 nm，蒸馏水调零。 2. AK241-D 置于 40℃水浴中预热 30 min。 3. 在 1mL 石英比色皿中依次加入下列试剂
注意：空白管只需测定一次 FAS 活性计算公式：a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下 1. 按照蛋白浓度计算 活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1 μmol NADPH 为 1 个酶活单位。 FAS (μmol/min/mg prot) = [(△A 测定管–△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×106]÷(Cpr×V 样)÷T=1.61×(△A 测定管–△A 空白管) ÷Cpr ※ 蛋白定量检测建议使用本公司：BCA Protein Assay Kit (C05-02001) 2. 按照样本质量计算 活性单位定义：37℃中每克组织每分钟氧化 1 μmol NADPH 为 1 个酶活单位。 FAS (μmol/min/g) = [(△A 测定管–△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×106]÷(W×V 样÷V 样总)÷T=1.61×(△A 测定管–△A 空白管) ÷W 3. 按细胞数量计算 活性单位定义：37℃中每 104 个细胞每分钟氧化 1 μmol NADPH 为 1 个酶活单位。 FAS (μmol/min/104cell) = [(△A 测定管–△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×106]÷(细胞数量×V 样÷V 样 总)÷T=1.61×(△A 测定管–△A 空白管) ÷细胞数量 4. 按液体体积计算 活性单位定义：37℃中每毫升样本每分钟氧化 1 μmol NADPH 为 1 个酶活单位。 FAS (μmol/min/mL) = [(△A 测定管–△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×106]÷V 样÷T=1.61×(△A 测定管–△A 空白管) 注： ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V 反总：反应体 系总体积，200μL=2×10-4L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W ：样品质量；V 样：加入反 应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL；V 样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间，1min。 b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下1. 按照蛋白浓度计算 活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1 μmol NADPH 为 1 个酶活单位。 FAS (μmol/min/mg prot) = [(△A 测定管–△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×106]÷(Cpr×V 样)÷T=3.22×(△A 测定管–△A 空白管) ÷Cpr 2. 按照样本质量计算 活性单位定义：37℃中每克组织每分钟氧化 1 μmol NADPH 为 1 个酶活单位。 FAS (μmol/min/g) = [(△A 测定管–△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×106]÷(W×V 样÷V 样总)÷T=3.22×(△A 测定管–△A 空白管)÷W 3. 按细胞数量计算 活性单位定义：37℃中每 104 个细胞每分钟氧化 1 μmol NADPH 为 1 个酶活单位。 FAS (μmol /min/104cell) = [(△A 测定管–△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×106]÷(细胞数量×V 样÷V 样 总)÷T = 3.22×(△A 测定管–△A 空白管) ÷细胞数量 4. 按液体体积计算 活性单位定义：37℃中每毫升样本每分钟氧化 1μmol NADPH 为 1 个酶活单位。 FAS (μmol /min/mL) = [(△A 测定管–△A 空白管)÷ε÷d×V 反总×106]÷V 样÷T=3.22×(△A 测定管–△A 空白管) ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5 cm；V 反总：反应体系 总体积，200μL=2×10-4L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W ：样品质量；V 样：加入反应 体系中上清液体积，20μL=0.02 mL；V 样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间，1min。 注意事项： 1. 配制好的试剂 4℃保存，三天内使用完毕。 |
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