半岛bd体育手机客户端 介绍
意义：磷酸戊糖途径中 6-磷酸葡萄糖脱氢酶 (G6PDH) 和 6PGDH 依次催化 NADPH 合成，与能 量的平衡、生长速率和细胞活力等密切相关。此外，6PGDH 逆境生理中具有重要作用。 原理：6PGDH 催化 6-磷酸葡萄糖酸和 NADP+生成 NADPH，NADPH 在 340 nm 有特征吸收峰，而 NADP+没有；通过测定 340nm 吸光度增加速率，计算 6PGDH 活性。 检测方法：分光光度法 半岛bd体育手机客户端 组成及保存条件：
※ 正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。 自备用品： 低温离心机、紫外分光光度计、水浴锅、可调式移液枪、1mL 石英比色皿和蒸馏水 AK123-B：临用前加入 5mL AK123-A 充分溶解备用 AK123-C：临用前加入 5mL AK123-A 充分溶解备用 1. 组织：按照组织质量(g)：AK123-A 体积(mL)为 1:5～10 的比例(建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL AK123-A)进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。 2. 细菌、真菌：按照细胞数量(104个)：AK123-A 体积(mL)为 500～1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL AK123-A)，冰浴超声波破碎细胞(功率 300w，超声 3 秒，间隔 7秒，总时间 3min)；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。 3. 血清、培养液等液体：直接测定。 1. 分光光度计预热 30min，调节波长到 340 nm，蒸馏水调零。 2. AK123-A 置于 25℃或 37℃水浴中保温 30min。 3. 按顺序加入下列试剂：
分别迅速混匀后于 340nm 处测定 3min 内吸光值变化，第 10s 吸光值记为 A 空 1，第 190s 吸光值记为 A 空 2，△A 空白管=A 空 2-A 空 1；于 340nm 处测定 3min 内吸光值变化，第 10 s 吸光值记为 A 测 3，第 190s 吸光值记 为 A 测 4，△A 测定管=A 测 4-A 测 3。 注：空白管只需要做一次。 6PGDH 酶活性计算公式：1. 按样本蛋白浓度计算 活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol NADPH 的酶量为 1 个酶活单位。 6PGDH (nmol/min/mg prot)= [(△A 测定管-△A 空白管)×V 反总÷ε÷d×109]÷(Cpr×V 样)÷T = 535.9×(△A 测定管-△A 空白管)÷Cpr ※ 蛋白定量检测建议使用本公司：BCA Protein Assay Kit (C05-02001) 2. 按样本质量计算 活性单位定义：每克组织每分钟催化产生 1nmol NADPH 的酶量为 1 个酶活单位。 6PGDH (nmol/min/g) = [(△A 测定管-△A 空白管)×V 反总÷ε÷d×109]÷(W×V 样÷V 样总)÷T= 535.9×(△A 测定管-△A 空白管)÷W 3. 按细胞数量计算 活性单位定义：每104个细胞每分钟催化产生 1nmol NADPH 的酶量为 1 个酶活单位。 6PGDH (nmol/min/104cell) = [(△A 测定管-△A 空白管)×V 反总÷ε÷d×109]÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T = 535.9×(△A 测定管-△A 空白管)÷细胞数量 4. 按液体体积计算 活性单位定义：每毫升液体每分钟催化产生 1nmol NADPH 的酶量为 1 个酶活单位。 6PGDH (nmol/min/mL) = [(△A 测定管-△A 空白管)×V 反总÷ε÷d×109]÷V 样÷T= 535.9×(△A 测定管-△A 空白管) 注：ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103L / mol /cm；d：比色皿光径，1 cm；V 反总：反 应体系总体积，0.001 L；Cpr：粗酶液蛋白质浓度，mg/mL，需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒；V 样：反应体系中加入粗酶液体积，0.1 mL；V 样总：加入提 取液体积，1mL；T：反应时间，3 min。 注意事项： 1. 样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在提取当日完成酶活性测定，粗酶液避免反复冻融； 2. AK123-B 和 AK123-C 须现配现用，当天未用完试剂保存在 4℃，可保存 2 天。 |
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