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6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)活性检测试剂盒(50T)
6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)活性检测试剂盒(50T)图片
货号: AK123
包装: 50T/48S
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货号: AK123
半岛bd体育手机客户端 别名: 6PGDH Assay Kit(50T)
半岛bd体育手机客户端 介绍

意义:磷酸戊糖途径中 6-磷酸葡萄糖脱氢酶 (G6PDH) 和 6PGDH 依次催化 NADPH 合成,与能 量的平衡、生长速率和细胞活力等密切相关。此外,6PGDH 逆境生理中具有重要作用。

原理:6PGDH 催化 6-磷酸葡萄糖酸和 NADP+生成 NADPH,NADPH 在 340 nm 有特征吸收峰,而 NADP+没有;通过测定 340nm 吸光度增加速率,计算 6PGDH 活性。

检测方法:分光光度法

半岛bd体育手机客户端 组成及保存条件:

编号

规格

储存条件

AK123-A

液体×1 瓶

4℃保存

AK123-B

粉剂×1 瓶

4℃保存

AK123-C

粉剂×1 瓶

4℃保存

※ 正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

自备用品:

低温离心机、紫外分光光度计、水浴锅、可调式移液枪、1mL 石英比色皿和蒸馏水
试剂预配制:

AK123-B:临用前加入 5mL AK123-A 充分溶解备用

AK123-C:临用前加入 5mL AK123-A 充分溶解备用
粗酶液提取:

1. 组织:按照组织质量(g):AK123-A 体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织, 加入 1mL AK123-A)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心 10min,取上清置冰上待测。

2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):AK123-A 体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL AK123-A),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7秒,总时间 3min);然后 8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。

3. 血清、培养液等液体:直接测定。
检测步骤:

1. 分光光度计预热 30min,调节波长到 340 nm,蒸馏水调零。

2. AK123-A 置于 25℃或 37℃水浴中保温 30min。

3. 按顺序加入下列试剂:

试剂名称

空白管 (ul)

测定管 (ul)

粗酶液


100

蒸馏水

100


AK123-B

100

100

AK123-A

700

700

AK123-C

100

100

分别迅速混匀后于 340nm 处测定 3min 内吸光值变化,第 10s 吸光值记为 A 空 1,第 190s 吸光值记为 A 空 2,△A 空白管=A 空 2-A 空 1;于 340nm 处测定 3min 内吸光值变化,第 10 s 吸光值记为 A 测 3,第 190s 吸光值记 为 A 测 4,△A 测定管=A 测 4-A 测 3。

注:空白管只需要做一次。

6PGDH 酶活性计算公式:

1. 按样本蛋白浓度计算

活性单位定义:每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol NADPH 的酶量为 1 个酶活单位。

6PGDH (nmol/min/mg prot)= [(△A 测定管-△A 空白管)×V 反总÷ε÷d×109]÷(Cpr×V 样)÷T = 535.9×(△A 测定管-△A 空白管)÷Cpr

※ 蛋白定量检测建议使用本公司:BCA Protein Assay Kit (C05-02001)

2. 按样本质量计算

活性单位定义:每克组织每分钟催化产生 1nmol NADPH 的酶量为 1 个酶活单位。

6PGDH (nmol/min/g) = [(△A 测定管-△A 空白管)×V 反总÷ε÷d×109]÷(W×V 样÷V 样总)÷T= 535.9×(△A 测定管-△A 空白管)÷W

3. 按细胞数量计算

活性单位定义:每104个细胞每分钟催化产生 1nmol NADPH 的酶量为 1 个酶活单位。

6PGDH (nmol/min/104cell) = [(△A 测定管-△A 空白管)×V 反总÷ε÷d×109]÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T = 535.9×(△A 测定管-△A 空白管)÷细胞数量

4. 按液体体积计算

活性单位定义:每毫升液体每分钟催化产生 1nmol NADPH 的酶量为 1 个酶活单位。

6PGDH (nmol/min/mL) = [(△A 测定管-△A 空白管)×V 反总÷ε÷d×109]÷V 样÷T= 535.9×(△A 测定管-△A 空白管)

注:ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103L / mol /cm;d:比色皿光径,1 cm;V 反总:反 应体系总体积,0.001 L;Cpr:粗酶液蛋白质浓度,mg/mL,需要另外测定,建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒;V 样:反应体系中加入粗酶液体积,0.1 mL;V 样总:加入提 取液体积,1mL;T:反应时间,3 min。

注意事项:

1. 样品处理等过程均需要在冰上进行,且须在提取当日完成酶活性测定,粗酶液避免反复冻融;

2. AK123-B 和 AK123-C 须现配现用,当天未用完试剂保存在 4℃,可保存 2 天。

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