细胞介绍

该细胞通过慢病毒转染的方式携带Luc基因、�/p>

细胞特�?/strong>

1)来源：小鼠黑色素瘣�/p>

2)形态：上皮细胞样贴壁生镾�/p>

3)含量�?gt;1x10⁶细胞�?/p>

4)规格：T25瓶或�?mL冻存管包裄�/p>

5)用途：仅供科研使用

细胞筛逈�/strong>

该细胞为稳定转染Luc的细胞，随细胞传代次数的增加，其Luc荧光强度会逐渐减弱。若实验要求需要维持荧光强度，可以加入嘌呤霉素进行再次筛选�

建议收到细胞后至少传3代，冻存留种后再进行筛选、�/p>

初次进行细胞筛选时，建议加入终浓度�?ug/ml嘌呤霉素的完全培养基维持培养，若无细胞漂浮或者漂浮较少，即可更换为含2ug/ml嘌呤霉素的完全培养基继续筛选，以此类推，至最高药物浓度为5ug/ml。若筛选过程中，漂浮细胞大�?0%，则停止筛选，换成正常培养基培养，至细胞密度约80%，可继续加入同浓度嘌呤霉素进行筛选。当加入5ug/ml嘌呤霉素时细胞正常增殖，可停止筛选，用不含药完全培养基正常培养、�/p>

运输和保字�/strong>

干冰运输及复苏好存活细胞

(1)1mL冻存管包装干冰运输，收到�?80度冰箱保存过夜后转入液氮或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系、�/p>

(2)T25瓶复苏的存活细胞常温发货，收到后按照细胞接收后的处理方法操作、�/p>

细胞接收后的处理

1)收到细胞后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置�?7℃培养箱放置�?-3h，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请拍照后及时联系我们、�/p>

2)请在4�?X显微镜下确认细胞状态，同时给刚收到的细胞拍�?10×�?0×)�?-3张以及培养瓶外观照片一张留存，作为售后时收到时细胞状态的依据、�/p>

3)贴壁细胞：细胞在37℃培养箱中放�?-3h，显微镜下观察细胞的生长和贴壁情况，有些贴壁细胞在快递运送过程中会因振动脱落和脱落后成团的情况。若镜下观察细胞的生长密度若�?0%以下，可去除培养瓶中灌液培养�?若有未贴壁的细胞需要离心回收，重悬打入到原培养瓶中),加入新配制的完全培养�?-8mL，放到细胞培养箱中继续培养。若细胞生长密度�?0%-80%以上，可以对细胞进行传代处理。传代过程中，若因运输振动脱落的细胞需要离心回收、�/p>

4)备注：运输用的培养基(灌液培养�?不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的完全培养基来培养细胞。收到细胞后**次传代建议T25培养�?�?传代 、�/strong>

一．培养基及培养冻存条件准夆�/strong>

1)准备DMEM(含NaHCO3 1.5g / L，推荐iCell-128-0001或者GIBCO,货号12800017，添加NaHCO3 1.5g/L)89 %，优质胎牛血�?0 %，P/S双抗1%

2)培养条件� 气相：空气，95%；二氧化碳，5%� 温度�?7摄氏度，培养箱湿度为70%-80%、�/strong>

3)冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配、�/p>

4)该细胞在DMEM(�?.5g/LNaHCO3)培养基中生长良好，大部分品牌的DMEM含有较高浓度的NaHCO3(3.7g/L)，若使用DMEM(3.7g/L NaHCO3)培养基培养细胞时需要提高CO2浓度(7%-10%)、�/strong>

二．细胞处理９�/strong>

1)冻存细胞的复苏：

将含�?mL细胞悬液的冻存管�?7℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离�?-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入�?-8ml完全培养基的培养�?或皿)�?7℃培养过夜。第2天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度、�/p>

2)细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养、�/p>

对于贴壁细胞传代可以参考以下方法：

1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次、�/p>

2.加入0.25%(w / v)胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶�?T25�?-2mL，T75�?-3mL)，置�?7℃培养箱中消�?-2分钟(难消化的细胞可以适当延长消化时间)，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加�?-4ml�?0%FBS的培养基来终止消化、�/p>

3.轻轻打匀后吸出，�?000RPM条件下离�?-5min，弃去上清液，补�?-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液�?�?的比例分到新T25瓶中，添�?-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况�?:2�?:5的比例进行、�/p>

3)细胞冻存: 收到细胞后建议在培养�?代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用、�/p>

下面T25瓶为例；

1. 细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度�?×106�?×107个活细胞/ml.

2. 1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细� ，按�?ml冻存液含1×106�?×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息、�/p>

3. 将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用、�/p>