细胞介绍

通过外植技术衍生自恶性胶质母细胞瘤肿瘤。

细胞特性

1)来源：U251胶质瘤耐药筛选

2)形态：贴壁细胞

3)含量：>1×10⁶细胞数

4)用途：仅供科研使用。

细胞运输、保存及注意事项

	复苏细胞	冻存细胞
包装	充液的T25细胞培养瓶	1mL冻存管
运输条件	常温	干冰
保存方式	75%酒精消毒瓶壁，置于37℃恒温细胞培养箱	-80℃冰箱中保存过夜后转入液氮/立即复苏
注意事项	1.收到细胞请先就培养瓶/冻存管的外观、细胞的状态，进行拍照并保存，如有问题请及时联系我们； 2.收到的复苏细胞，若有较多细胞飘起，可能由于运输导致。请先置于37℃细胞培养箱中静置2～4h，待细胞贴壁后再做处理； 3.复苏细胞充液培养基为不含药物的维持培养基，收到细胞后请及时更换为完全培养基； 4.建议收到细胞后，首先进行扩增，并冻存部分细胞以备用。

细胞耐药诱导过程

待细胞生长稳定后，开始倍增药物诱导剂量，每个剂量保持至细胞可以稳定生长至汇合度达50%以上。递增药物浓度依次为：0.125μg/mL，0.25μg/mL，0.5μg/mL，1μg/mL，2μg/mL，4μg/mL，8μg/mL，16μg/mL。约8个月后，细胞可在16μg/mL TMZ药物浓度下稳定生长，视为耐药细胞株构建成功，并命名为U251 MG/TMZ。

细胞培养试剂的配制

1)TMZ药物的配制及保存

建议将TMZ药物配制成16mg/mL的母液：即使用1mL DMSO溶液溶解16mg TMZ药物，使其完全溶解。

注意：可根据用量配置药物，并将药物分装保存，避免反复冻融导致药物失效。溶解后的TMZ，4℃保存1周，-20℃保存1个月，-80℃保存6个月。

2)冻存液的配制

90%优质胎牛血清+10%DMSO，现用现配。

3)完全培养基的配制(推荐使用iCell-h229-001b)

成分	体积/浓度
优质胎牛血清	10%
双抗	1%
TMZ	0～16μg/mL
DMEM培养基	补充至所需体积

细胞培养条件

气相：空气，95%；二氧化碳，5%；温度：37℃，培养箱湿度为70%～80%。

细胞处理

1)冻存细胞的复苏

将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4～6mL完全培养基的离心管中混合均匀，1000rpm/min离心3～5min，弃去上清液。加入1mL完全培养基重悬细胞后，均匀铺于含6～8mL完全培养基的培养瓶(或皿)中，置于37℃恒温细胞培养箱中过夜培养。第2天显微镜下观察细胞生长情况，2～3day换液。

注意：①细胞复苏过程中，不可使用含有药物的培养基。须在细胞完全贴壁，形态完全展开，生长状态稳定后，方可根据实验需要添加TMZ药物。若加药后细胞生长状态较为缓慢，可适当降低TMZ的浓度，或使用不含TMZ的完全培养基培养至细胞生长状态较好时，再更换为所需的TMZ浓度；

②建议复苏细胞时始终穿戴防护手套和面罩，避免冻存管因温差较大而发生爆炸，造成人员伤害。

2)细胞传代(建议以同等底面积的培养瓶/皿按照1：2比例传代)

①待细胞密度达到80%～90%时，即可进行传代培养。

②弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1次，吸净残余的PBS。

③加入适当体积的0.25%(w / v)胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中(T25瓶-1mL，其它培养器皿可覆盖培养底面即可)，置于37℃培养箱中消化2～5min，显微镜下观察细胞细胞大部分变圆并脱落，即可轻拍培养瓶使细胞全部脱落。迅速拿回操作台，加入2倍体积的、含10%FBS的培养基中止消化。

④将细胞悬液移入离心管中，1000rpm/min离心5min，弃去上清液。

⑤向细胞沉淀中加入1～2mL完全培养基重悬细胞，轻吹混匀。将细胞悬液按1：1的比例均匀铺于2个新的培养瓶/皿中，添加6～8mL完全培养基，置于37℃恒温细胞培养箱中培养。第2天显微镜下观察细胞生长情况，2～3day换液。

注意：细胞传代过程中，不可使用含有药物的培养基。须在细胞完全贴壁，形态完全展开，生长状态稳定后，方可根据实验需要添加TMZ药物。若加药后细胞生长状态较为缓慢，可适当降低TMZ的浓度，或使用不含TMZ的完全培养基培养至细胞生长状态较好时，再更换为所需的TMZ浓度。

3)细胞冻存

①细胞冻存时，步骤同2)细胞传代的①～④，细胞计数后，加入配制好的细胞冻存液，重悬细胞，按照1×106～ 1×107个细胞/mL分配到一个冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。

②将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80℃冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。同时记录好冻存管在液氮容器中的位置以便后续查阅和使用。