测定原理:
TrxR催化NADPH还原DTNB生成TNB和NADP+,TNB在412nm有特征吸收峰,通过测定412nm波长处TNB的增加速率,即可计算TrxR活性。
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可见分光光度计、低温离心机、可调节移液器、1ml玻璃比色皿和蒸馏水。
试剂组成和配制:
试剂一:液体×1 瓶,4°C保存
试剂二:液体×1 瓶,4°C避光保存。
试剂三:粉剂L×1 瓶,4°C保存。临用前加入5ml蒸馏水溶解。
粗酶液提取:
粗酶液提取详见说明书。测定组织和细胞同时需要测定蛋白浓度。
TrxR测定操作:
1、分光光度计预热30min后,调节波长到412nm,用蒸馏水调零。
2、试剂一在25°C(一般物种)或者37°C(哺乳动物)预热30min。
3、空白管:取1ml玻璃比色皿,加入100μl试剂二,100μl试剂三,800μl试剂一,迅速混匀后于412nm测定10s和310s吸光度,记为A1和A2。△A空白管=A2-A1。
4、测定管:取取1ml玻璃比色皿,加入100μl试剂二,100μl试剂三,700μl试剂一,100μl上清液,迅速混匀后于412nm测定10s和310s吸光度,记为A3和A4。△A测定管=A4-A3。