鱼磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶实验测定具体步骤:
1.确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目,并增加 1 孔作为 TMB 空白显色孔。 总数=样品数+9;做双份检测时×2。其余重包装好放如冰箱中。
2.将标准品各 0.1ml 依次加入一排 7 孔中,1 孔只加样品稀释液的作为零孔。对于血清、体液、 组织匀浆或细胞培养上清,直接加已用样品稀释液稀释的样品 100μ ι 。
3.酶标板加上盖,37℃反应 90 分钟。
4.反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体;或甩去酶标板内液体,再对着吸水纸拍几下。 不洗。
5.将准备好的生物素抗体工作液按每孔 0.1ml 依次加入。(TMB 空白显色孔除 外)。37℃反应 60 分钟。
6. 0.01M TBS 或 0.01M PBS 洗涤 3 次,每次浸泡 1 分钟左右。
7.将准备好的 ABC 工作液按每孔 0.1ml 依次加入(TMB 空白显色孔除外)。37℃反应 30 分钟。
8. 0.01M TBS 或 0.01M PBS 洗涤 5 次,每次浸泡 1-2 分钟左右。
9.按每孔 90μ ι 依次加入已在 37℃平衡 30 分钟的 TMB 显色液,37℃避光反应 20-25 分钟 (注意:显色时间供参考,因用户实验室条件差异,显色时间会有所不同。此时肉眼可 见标准品的前 3-4 孔有明显的梯度蓝色,后 3-4 孔差别不明显)。
10.按每孔 0.1ml 依次加入 TMB 终止液,此时蓝色立转黄色。
11.用酶标仪在 450nm 测定 O.D.值。