鱼磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶实验测定具体步骤：

1．确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目，并增加 1 孔作为 TMB 空白显色孔。 总数=样品数+9；做双份检测时×2。其余重包装好放如冰箱中。

2．将标准品各 0.1ml 依次加入一排 7 孔中，1 孔只加样品稀释液的作为零孔。对于血清、体液、 组织匀浆或细胞培养上清，直接加已用样品稀释液稀释的样品 100μ ι 。

3．酶标板加上盖，37℃反应 90 分钟。

4．反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体；或甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下。 不洗。

5．将准备好的生物素抗体工作液按每孔 0.1ml 依次加入。（TMB 空白显色孔除 外）。37℃反应 60 分钟。

6． 0.01M TBS 或 0.01M PBS 洗涤 3 次，每次浸泡 1 分钟左右。

7．将准备好的 ABC 工作液按每孔 0.1ml 依次加入（TMB 空白显色孔除外）。37℃反应 30 分钟。

8． 0.01M TBS 或 0.01M PBS 洗涤 5 次，每次浸泡 1-2 分钟左右。

9．按每孔 90μ ι 依次加入已在 37℃平衡 30 分钟的 TMB 显色液，37℃避光反应 20-25 分钟 （注意：显色时间供参考，因用户实验室条件差异，显色时间会有所不同。此时肉眼可 见标准品的前 3-4 孔有明显的梯度蓝色，后 3-4 孔差别不明显）。

10．按每孔 0.1ml 依次加入 TMB 终止液，此时蓝色立转黄色。

11．用酶标仪在 450nm 测定 O.D.值。