实验报告：

一、BEL-7402(肝癌细胞)分离与培养：

    1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，最后将组织剪成1mm3左右大小；

    2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

    3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织完全被消化；

    4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

    5、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；

二、免疫荧光鉴定：

    1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

    2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

    3、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；

    4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗（Abbioscience公司），然后将其放在4℃箱中孵育细胞过夜；

    5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

    6、用PBS冲洗3次，每次10min，最后在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

特性：

安全性：所有肿瘤和病转染的细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需高压灭菌后方能丢弃。收到细胞后，在倒置镜下好是在4X物镜)观察整个细胞生长情况

（一）如果细胞未长满，用75%酒精喷洒整个瓶消后放到超菌台内，严格无菌操作，打开细胞培养瓶，吸出培养液，换 10ml新鲜培养液后继续培养。

(二)如果细胞已长满，即可进行传代培养。具体步骤如下：

1. 弃去培养液，用PBS（不含钙,镁离子）洗1-2次。

2. 加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，倒放于37℃培养箱1-3分钟预热，之后翻转培养瓶10-30秒后，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量完全培养基终止消化。

3. 按6-8ml/瓶补加完全培养基，轻轻打匀后吸出一半，分到新的培养瓶中。

细胞特性：

1)组织来源于实验动物的正常眼组织。

2)细胞鉴定：细胞角蛋白-18(CK-18)免疫荧光染色为阳性。

3)经鉴定细胞纯度高于90%。

4)不含有 HIV-1、 HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。

5)细胞生长方式：上皮样，不规则细胞，贴壁培养。

注意事项：

1、观察细胞zui好在低倍镜（4或5X物镜)下进行，否则不能准确判断细胞的传代密度。看细胞的形态请在10X或20X物镜下。

2、瓶中运输培养基不能重复再用,请换用加双抗的新培养基，细胞冻存后,培养基中可不加任何抗生素。

3、有些细胞贴壁不牢，如发现贴壁细胞有脱落，可离心吹打后接种到新瓶内。

4、收到细胞后，若发现培养瓶破损、有液溢出及细胞有污染，请及时与我们。

CAPS2 (Calcyphosin-2) ELISA KITPorcine MMP-9(Matrix Metalloproteinase 9) ELISA Kit2-萘甲醛组织半胱氨酸蛋白酶-7（CASPASE-7）活性比色法定量检测试剂盒

CCIN (Calicin) ELISA KITPorcine MYO(Myoglobin) ELISA Kit2-萘甲醛细胞半胱氨酸蛋白酶-7（CASPASE-7）活性荧光定量检测试剂盒

CAMSAP1 (Calmodulin-regulated spectrin-associated protein 1) ELISA KITPorcine NGAL(Neutrophil Gelatinase Associated Lipocalin) ELISA Kit2-萘甲醛组织半胱氨酸蛋白酶-7（CASPASE-7）活性荧光定量检测试剂盒

AP1M1(AP-1 complex subunit mu-1) ELISA KitPorcine NGF(Nerve Growth Factor) ELISA KitN-乙基苄胺细胞半胱氨酸蛋白酶-8（CASPASE-8）活性比色法定量检测试剂盒

COMTD1 (Catechol O-methyltransferase domain-containing protein 1) ELISA KITPorcine NOS3/eNOS(Nitric Oxide Synthase 3, Endothelial) ELISA KitN-乙基苄胺组织半胱氨酸蛋白酶-8（CASPASE-8）活性比色法定量检测试剂盒

CASQ1 (Calsequestrin-1) ELISA KITPorcine NPY(Neuropeptide Y) ELISA KitN-丁基溴化吡啶细胞半胱氨酸蛋白酶-8（CASPASE-8）活性荧光定量检测试剂盒

CTNND1 (Catenin delta-1) ELISA KITPorcine NT-3(Neurotrophin-3) ELISA KitN-丁基溴化吡啶组织半胱氨酸蛋白酶-8（CASPASE-8）活性荧光定量检测试剂盒

CTCF (Transcriptional repressor CTCF) ELISA KITPorcine Ntn1(Netrin 1) ELISA KitN-丁基溴化吡啶细胞半胱氨酸蛋白酶-9（CASPASE-9）活性比色法定量检测试剂盒

PDE7B(cAMP-specific 3′,5’-cyclic phosphodiesterase 7B) ELISA KitCoronin 3  冠蛋白3抗体2-叔丁基蒽醌厚朴酚进口/国产Angiomotin  血管抑结合蛋白抗体含量：HPLC≥98%

PDRG1 ELISA KitAggrecan1  软骨蛋白聚糖抗体2-叔丁基蒽醌和厚朴酚进口/国产HIP4/CBS  丝氨酸羧半胱氨酸合成酶抗体含量：HPLC≥98%

PDS5A ELISA Kitphospho-ANAPC1 (Ser355)  磷酸化细胞周期末期促进复合蛋白APC1抗体四甲基脲番泻苷A进口/国产ACE2  血管紧张转换酶2抗体含量：HPLC≥98%

PDE6A ELISA KitDAD1  细胞死亡防卫蛋白1抗体四甲基脲番泻苷B进口/国产ACEI  血管紧张1转换酶抑制剂抗体含量：HPLC≥99%

PDCD5 ELISA KitTCERG1/CA150  转录延伸调节蛋白1抗体松油醇番泻苷C进口/国产Acetyl CoA Carboxylase  酰辅酶A羧化酶抗体含量：HPLC≥98%

PDE6B ELISA KitCAB39L  钙结合蛋白样39抗体酪氨酸酶番泻苷D进口/国产Phospho-Acetyl CoA Carboxylase(Ser79)  酸化酰辅酶A羧化酶抗体含量：HPLC≥98%

PXDN(Peroxidasin homolog) ELISA KitAggrecanase-2/ADAMTS-5  软骨蛋白聚糖抗体酪氨酸酶紫草进口/国产ACD  上皮质发育异常蛋白抗体含量：HPLC≥99%

PDCD6 ELISA KitCAGE1/CT3/CT95  肿瘤/睾丸抗原3抗体四丁基碘化铵川楝进口/国产ACHE/Acetylcholinesterase  酰胆酶抗体含量：HPLC≥98%

特性：

安全性：所有肿瘤和病转染的细胞均视为有潜在的生物危害性，必须在二级生物安全台内操作，并请注意防护，所有废液及接触过此细胞的器皿需高压灭菌后方能丢弃。收到细胞后，在倒置镜下好是在4X物镜)观察整个细胞生长情况

（一）如果细胞未长满，用75%酒精喷洒整个瓶消后放到超菌台内，严格无菌操作，打开细胞培养瓶，吸出培养液，换 10ml新鲜培养液后继续培养。

(二)如果细胞已长满，即可进行传代培养。具体步骤如下：

1. 弃去培养液，用PBS（不含钙,镁离子）洗1-2次。

2. 加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，倒放于37℃培养箱1-3分钟预热，之后翻转培养瓶10-30秒后，在倒置显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量完全培养基终止消化。

3. 按6-8ml/瓶补加完全培养基，轻轻打匀后吸出一半，分到新的培养瓶中。